爬行纲β-defensin基因多态性分析及基于真核表达的生物学功能验证

来源 :大连理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:tm7749
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Defensin是宿主防御肽(hose defense peptides, HDPs)家族的重要成员之一,广泛存在于几乎所有物种,包括脊椎动物、无脊椎动物、昆虫、植物甚至微生物。Defensins除了具有直接的杀菌功能外,还具有免疫调节功能,是连接宿主自然免疫和获得性免疫的桥梁。目前,defensin成为少数几类进入临床研究的肽类抗生素之一,该家族的PMX-30063已经完成了系统性感染适应症的Ⅰ期临床,金葡菌引起的急性细菌性皮肤感染适应症也已完成临床Ⅱ期。  爬行纲物种的肽类分子由于活性强、效价高,成为了先导模板发掘的重要来源。而爬行纲defensin却鲜有报道,且仅限于基因克隆,缺少相应的功能验证。本研究在NCBI爬行纲数据库中定向发掘得到了26条全新的β-defensins序列,属于爬行纲龟鳖目鳖科中华鳖属(Pelodiscus sinensis),分别命名为Ps-BD1~26。Ps-BDs具有β-defensin家族共有的特征:其前体由高度保守的信号肽区域,极短的中间间隔区以及成熟肽区域组成。尽管Ps-BDs成熟肽区是高度变异的,但仍含有β-defensin家族6个保守的Cys残基以及 GXC基序。通过构建的系统发育树分析得出β-defensin是一类高速率序列替换的进化速率较快的基因,而多重基因复制是导致其成熟肽区域高度差异性的原因。  随后对Ps-BDs的组织表达谱及结构进行研究,试图解析β-defensin在宿主体内可能参与的防御反应及行使生物学功能的结构基础。通过RT-PCR获得了Ps-BD2、Ps-BD6、Ps-BD11、Ps-BD16以及Ps-BD21的组织表达谱,结果显示:在与外源性物质发生直接接触的器官(皮肤,肺,胃)以及与机体免疫相关的器官(肝脏,肾脏,小肠)中Ps-BDs的表达量均较高。利用Rosetta ab initio对5条代表性Ps-BDs同源建模,揭示了Ps-BDs主要含有β-片层结构,少数还含有两亲性的α-helix结构,而这两种二级结构恰是β-defensin家族行使生物学功能的结构基础。  最后,我们构建了毕赤酵母真核表达载体,对Ps-BD2进行了高效表达,纯化后得到重组蛋白rPs-BD2,并进行了生物学功能验证。结果表明rPs-BD2具有广谱抗菌活性,相较于革兰氏阴性菌以及真菌,其对革兰氏阳性菌的活性更强。同时rPs-BDs对正常细胞几乎没有毒性,对红细胞无溶血性。进一步证明了defensin在宿主对抗外界病原微生物感染起重要作用,同时rPs-BD2在未来的临床应用上也具有一定的指导意义。
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