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研究背景食管癌是我国消化道恶性肿瘤之一,死亡人数约占全部恶性肿瘤死亡人数的1/4,居恶性肿瘤死亡率第四位,仅次于肝癌,肺癌,和胃癌。目前认为早期发现、早期诊断、早期治疗是提高食管癌治疗效果的关键。早期治疗中临床手术治疗是食管癌的主要治疗手段之一,但切除后复发和远处转移严重影响了食管癌患者的治愈率和生存率。放疗和化疗虽疗效肯定,但其副作用严重影响患者生存质量。光动力学疗法(Photodynamic therapy, PDT)利用光敏剂和合适波长的光,近20多年已应用于许多肿瘤的临床治疗,包括食管癌癌前病变、早期癌根治治疗,晚期癌姑息性治疗。但是仍存在许多患者对PDT应答的敏感性低下,并已成为临床食管癌光动力治疗的难题之一,因此弄清影响食管癌光动力学疗效的因素及其作用机制将有助于寻找提高PDT临床疗效的新方法和新思路并针对不同肿瘤患者制定合理的个体化治疗方案,从而提高患者疗后生存率。以往的研究提示多种因素能够影响PDT效果,这些因素除所选用的光敏剂、光波长和氧分子以外,还包括肿瘤细胞的生物性状(如细胞分化状态)、机体的免疫状态、细胞内某些促凋亡基因和抑凋亡基因的表达水平与活性水平等。由于光动力学效应需依赖分子氧的存在,氧分子的缺乏能够导致单态氧产量不足,因而PDT效果下降。但在多数实体肿瘤中往往存在低氧状态。实体瘤组织的缺氧导致缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的泛素介导蛋白酶体降解过程受到抑制,细胞内水平增加。HIF-1α作为一种转录因子,能激活多种基因的表达,如促红细胞生成素(EPO)、血管内皮生长因子(VEGF)、多药耐药基因(MDR1),还有一些与能量代谢有关的酶类,均与细胞存活、增殖、血管生成、侵袭、耐药等相关,因而HIF-1α有可能影响到临床PDT的疗效。除此之外,据报道证实HIF-1α也与细胞凋亡相关,由于PDT对肿瘤细胞杀伤的重要机制之一就是诱导细胞凋亡,推测HIF-1α的表达水平有可能影响到PDT的杀伤效应,因而蛋白HIF-1α的表达状况对PDT效应的影响及其作用机制是我们研究的重要内容之一。本研究利用化学诱导法建立食管癌细胞缺氧模型,并构建能长效抑制蛋白HIF-1α表达的抑制载体,了解蛋白HIF-1α表达与食管鳞癌细胞PDT效应的关系,观察HIF-1α蛋白抑制后对PDT细胞杀伤功能的影响,为临床上通过调控基因表达而提高PDT的疗效奠定理论和实验基础。本研究共分为以下两部分：第一部分,长效抑制HIF-1α表达载体的构建鉴定和稳定细胞株的筛选。第二部分,干扰HIF-1α蛋白诱导表达对食管癌细胞光动力学效应的影响。研究目的1,构建HIF-lαshRNA抑制载体,通过细胞稳定转染的方法建立长效抑制HIF-1α蛋白表达的食管鳞癌EC-9706细胞株,为研究其影响PDT效应的功能奠定基础。2,观察化学法诱导HIF-1α蛋白表达和干扰HIF-1α蛋白表达后对常氧条件培养的食管鳞癌细胞的细胞增殖的影响。3,研究蛋白HIF-1α诱导表达及阻断HIF-1α蛋白诱导表达对食管鳞癌细胞PDT处理后的细胞存活率与细胞凋亡率,明确HIF-1α的表达与食管鳞癌光动力学效应的关系。研究方法1.根据siRNA干扰原理,利用WHITEHOUSE和siDirect在线设计软件以及Rational siRNA Design软件设计siRNA干扰序列。2.根据载体插入位点将siRNA干扰序列转换为shRNA序列；将设计成功的干扰序列连入PENTRTM/H1/TO载体和pEZsiRNA6.1载体。3.利用脂质体转染法将构建得到的有效干扰质粒载体转染入食管鳞癌细胞(EC-9706细胞)中,应用倒置荧光显微镜的观察,蛋白印迹法确定蛋白干扰效果。4.利用MTT法检测抑制HIF-1α蛋白诱导表达细胞及对照细胞常氧时生长状态；对比观察HIF-1α诱导表达及抑制诱导表达的细胞在PDT处理后的细胞存活率。5.利用流式细胞法检测干扰HIF-1α蛋白表达前后细胞凋亡率。研究结果1.瞬时转染及western blot结果表明设计的siRNA序列能够明显抑制HIF-1 a蛋白的表达；以此siRNA序列设计出shRNA序列,连接载体,PCR和测序结果证实成功构建重组质粒pEZsiRNA6.1-hif-105;以此重组质粒转染食管鳞癌细胞系,荧光显微镜观察和western blot鉴定结果表明成功得到能抑制HIF-1 a蛋白诱导表达的稳定细胞系。2.化学诱导法成功建立了食管鳞癌缺氧细胞模型；常氧条件培养稳定细胞,干扰HIF-1 a蛋白诱导表达组和未干扰HIF-1 a蛋白诱导表达组细胞增殖曲线基本一致,无显著性差异(P>0.05)。3.细胞CoCl2化学诱导后,PDT处理,干扰HIF-1 a蛋白表达组(EC-9706-pEZsiRNA6.1-hif-105细胞)与未干扰HIF-1 a蛋白表达组(EC-9706-pEZsiRNA6.1-neg细胞)细胞存活率分别为69.27%±5.21和88.36%±2.81,有显著性差异(P<0.01),表明HIF-1 a蛋白的表达抑制了PDT作用效果。4.流式检测PDT后的细胞凋亡,EC-9706-pEZsiRN A6.1-hif-105细胞组与EC-9706-pEZsiRNA6.1-neg细胞组早期凋亡率分别为29.31±2.75%和13.99±0.89%,有显著性差异(P<0.05),提示HIF-1α蛋白抑制PDT对肿瘤细胞的杀伤作用,至少部分是通过抑制细胞凋亡而实现。研究结论1.成功建立了稳定干扰HIF-1α表达的食管鳞癌细胞EC-9706-pEZsiRNA6.1-hif-105细胞。2. HIF-1α的高表达能够抑制PDT对肿瘤细胞的杀伤作用；干扰HIF-1α蛋白诱导表达增强了PDT效应。3. HIF-1α使细胞具备抵御PDT细胞毒性作用部分是通过抑制凋亡而实现。