R-spondin2在人牙髓干细胞增殖和成牙分化过程中的作用及相关机制的研究

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[研究背景]牙齿萌出后,由机械损伤、化学暴露以及龋齿等导致的牙体组织损伤会诱导修复性牙本质的形成以作为保护牙髓的屏障。来源于牙髓的干细胞(DPSCs)被认为会形成终末分化的成牙本质细胞以形成修复性牙本质。经典Wnt/β-catenin信号通路在组织生成,再生和自我更新中起着至关重要的作用,当牙髓对损伤做出反应时,内源性Wnt/β-catenin信号通路将被激活,这些Wnt/β-catenin激活的细胞将进行随后的修复反应。重组生长因子已成功被应用于临床,参与调节Wnt/β-catenin信号通路的生长因子可能会影响DPSCs的生物学功能,是有望用于调节DPSCs向成牙本质细胞分化,促进牙本质再生及修复性牙本质形成的分子。R-spondin 2(Rspo2)是强有力的干细胞生长因子,可显著增强Wnt/β-catenin信号通路的活性,并参与多种来源干细胞的增殖分化和组织再生,然而Rspo2对hDPSCs生物学功能的影响尚未得到研究。本研究拟探索Rspo2对hDPSCs增殖及成牙分化的影响,以期对牙本质再生和促进修复性牙本质的形成提供一定的理论基础。[方法](1)用酶消化法联合组织块法从入的磨牙或前磨牙中提取hDPSC。免疫荧光染色检测细胞干细胞标记物的表达,流式细胞分析检测hDPSCs表面抗原分子表型。(2)分别给予第三代hDPSCs不同浓度和时间的rhRspo2作用,CCK-8和EdU实验检测细胞增殖能力的改变,ALP活性检测hDPSCs矿化能力的改变,qRT-PCR检测成牙相关基因DSPP、DMP-1、ALP和BSP的RNA表达。(3)通过慢病毒转染技术构建Rspo2沉默细胞系,探究沉默Rspo2对hDPSC增殖、成牙分化以及信号通路的影响。CCK-8和EdU实验检测Rspo2沉默后细胞增殖能力的改变,qRT-PCR和western blot检测成牙相关基因RNA和蛋白表达,western blot和免疫荧光染色检测β-catenin的表达量和空间位置。(4)用重组人DKK-1(rhDKK-1)抑制Wnt/β-catenin信号通路后,检测rhRspo2作用下hDPSCs成牙分化能力及Wnt/β-catenin通路活性的改变,并检测重组人Wnt3a(rhWnt3a)对rhRspo2激活Wnt/β-catenin信号通路的影响,进一步明确Rspo2对hDPSCs作用的分子机制。[结果](1)hDPSCs阳性表达干细胞标记蛋白Vimentin、Stro-1、Nestin和C-kit以及干细胞标记分子CD90和CD73,而不表达CD3、CD31和CD34。(2)经rhRspo2诱导的hDPSCs增殖能力和矿化能力增强,成牙相关基因DSPP、DMP1、ALP和BSP的RNA表达水平上调。(3)沉默Rspo2抑制了 hDPSCs的增殖和成牙向分化,同时抑制Active β-catenin的表达及核内聚集;rhRspo2可一定程度挽救Rspo2沉默细胞的成牙分化能力。(4)用rhDKK-1阻断Wnt/β-catenin信号通路可抑制rhRspo2介导的Wnt/β-catenin 信号通路活性增强和成牙分化的促进;rhWnt3a 和 rhRspo2 的联合使用可协同促进Wnt/β-catenin信号通路的激活。[结论]成功分离出人牙髓间充质干细胞,Rspo2在hDPSCs中是Wnt/β-catenin信号通路的激动剂,可提高hDPSCs的增殖和成牙分化能力。
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