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目的:β3-GalT7基因是本实验室应用电子克隆技术最早发现的β1,3连接糖基转移酶家族新基因,根据序列同源性分析,将其归入β1,3-半乳糖基转移酶家族,命名为β3GALT7。本文旨在对中度表达β3–GalT7基因的人胃癌细胞株SGC7901进行蛋白组学研究,并通过构建β3-GalT7基因上调及下调亚细胞模型的2-DE图谱,建立差异蛋白组学研究平台,寻找随β3-GalT7表达改变而发生表达量变化的蛋白质分子,对β3-GalT7基因的功能进行初步研究。方法:1.对本室保藏的β3-GalT7正义表达载体pEGFP-C1-T7s和反义表达载体pEGFP-C1-T7as进行了双酶切鉴定、PCR鉴定及测序验证。2.采用阳离子脂质体包裹质粒转染的方法,设计梯度转染体系,以最高转染效率和最低细胞死亡率为原则,优化表达载体转染SGC7901细胞的条件。3.制备正义及反义表达载体,按照最优转染体系转染SGC7901细胞。转染后24小时抽提RNA,RT-PCR鉴定β3–GalT7基因在转录水平的改变;转染后48小时提取总蛋白,WesternBlot鉴定β3–GalT7在蛋白水平的改变。4.使用安玛西亚公司的双向电泳、图像扫描系统及图像分析软件,选择合理pH范围及长度的IPG胶条,同时对样品裂解方法、电泳上样量、电泳条件、染色方法进行优化,分别构建SGC7901细胞细胞株及其β3-GalT7基因上调及下调亚细胞模型的2-DE图谱。5.应用ImageMater 2D Platinum5.0软件分析三个蛋白样品的2-DE图谱,对匹配蛋白点群进行Groups report分析,蛋白点定量采取Vol%标准化,筛选出表达量有明显变化的蛋白质点。结果:1.本室保藏的β3-GalT7正义表达载体pEGFP-C1-T7s及反义表达载体pEGFP-C1-T7as基因装载正确,但是存在少数点突变。2.分别对6种转染体系转染效率进行比较,综合最高转染效率与最低细胞死亡率的优化原则,最终选择每1×105个细胞0.75ug质粒+1.5ul脂质体的转染比例。3.RT-PCR及WesternBlot结果显示,转染了正义表达载体pEGFP-C1-T7s的亚细胞模型,β3-GalT7上调表达;转染了反义表达载体pEGFP-C1-T7as的亚细胞模型,β3-GalT7下调表达,模型构建成功。4.IEF使用pH3-10、11cm线性IPG胶条,上样200ug所构建的考染图谱蛋白点集中分布在等电点pH 3.8-7.3的范围内,分离效果较差。改用pH4-7 24cm线性IPG胶条,分别构建了考染图谱及银染图谱,蛋白点聚焦充分,饱满无拖尾,无明显横条纹及竖条纹,可用于下游差异蛋白组学分析。5.转染组及对照组2-DE图谱匹配蛋白点群的灰度分析显示,共存在22个有变化趋势的差异蛋白点,其中7个下调表达,15个上调表达。获取了这些蛋白点的等电点及分子量信息。结论:在最优转染条件下,采用瞬时转染方法,成功构建人胃癌细胞株SGC7901β3-GalT7上调及下调亚细胞模型,RT-PCR及WesternBlot鉴定结果吻合。建立了人胃癌细胞株SGC7901双向电泳分析技术平台,构建了重复性及分离效果较好的2-DE图谱,通过对亚细胞模型样品的差异蛋白组学分析,初步获取了差异蛋白点的信息,为下一步进行质谱鉴定及β3–GalT7基因功能的深入研究打下基础。