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盐、旱胁迫严重影响作物产量,因而分离耐逆相关基因、培育耐逆作物新品种非常重要。本实验室利用不对称体细胞杂交创制渐渗系技术,培育出了普通小麦(Triticum aestivum L.2n=42) JN177和长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum2n=70)的小麦渐渗系耐盐、抗旱新品种山融3号(SR3)。SR3基因组发生了高频率的遗传和表观遗传学变异,是分离耐逆相关基因的优良材料。离子转运蛋白负责离子的吸收、外排或者转运,是植物响应盐、旱胁迫的重要组分。实验室前期通过组学分析,发现SR3的耐逆能力与其较强的离子平衡重建能力密切相关。本论文根据转录组分析结果,克隆了两个在SR3及其亲本JN177间差异表达的离子转运体基因,即负责丙酮酸转运的TaBASS2及负责钾离子转运的TaHAK11;初步分析了它们的生物学功能及在非生物胁迫下的作用机制。1胆汁酸：钠离子共转运蛋白基因TaBASS2的功能研究TaBASS2编码一个胆汁酸：钠离子共转运蛋白,在叶片中定位在叶绿体膜上,而在根中可能定位于白色体等其它质体中。TaBASS2主要在地上部分表达,而根中表达量较低。SR3三叶期幼苗中,盐胁迫下TaBASS2在叶片中下调表达、根中上调表达,旱处理下在根和叶中都下调表达,ABA处理后根和叶片中都是上调表达的,而过氧化氢处理下仅在根中上调表达。TaBASS2在酵母中不能转运Na+和丙酮酸,而在拟南芥中则能介导丙酮酸盐的跨叶绿体膜转运。TaBASS2的异源过表达提高了拟南芥AtNHD1的表达水平,推测TaBASS2转运丙酮酸依赖NHD1。TaBASS2过表达不影响拟南芥的种子萌发率,但抑制了子叶张开率以及幼苗的生长。研究表明,叶绿体逆行信号途径参与了幼苗早期发育调控。我们发现,TaBASS2过表达不影响MEcPP以及PAP信号途径关键组分AtHPL以及AtSAL1的表达；达草灭及洁霉素处理后,TaBASS2过表达系中四毗咯途径及PGE途径中下游应答基因AtLHCB1.1及AtLHCB2.4的表达被抑制程度明显降低。结果表明,TaBASS2可能通过抑制质体逆行信号转导中的四吡咯及PGE途径影响幼苗发育,而与MEcPP以及PAP信号途径无关。NaCl及ABA处理下,TaBASS2过表达系与Col-0的种子萌发率没有差异。TaBASS2过表达降低了子叶张开期幼苗对NaCl的耐受性、提高了对ABA的敏感性。但TaBASS2增强了拟南芥幼苗对盐胁迫、渗透胁迫和氧化胁迫等非生物胁迫的抗性以及对外源ABA的耐受性。我们发现,ABA合成途径中的关键酶AtAAO3、 AtNCED3以及ABA依赖的胁迫应答途径中AtMYC2、AtRD29B、AtRD22和AtRAB18表达也显著上调,表明TaBASS2可能通过促进ABA的合成及信号转导途径影响植株对非生物胁迫的响应。我们发现,TABASS2过表达株系中H202与’02含量明显提高,H202应答基因AtFER1及102应答基因AtAAA-ATPase和AtBAP1表达明显上调,ROS清除酶CAT活性及AtAPX2和AtCAT1表达也明显增强,表明H2O2及1O2参与了TaBASS2过表达株系对非生物胁迫的响应。总之,TaBASS2通过促进ABA生物合成与信号途径以及增强ROS信号途径提高拟南芥植株对非生物胁迫的抗性。至于子叶张开期幼苗应答非生物胁迫的机制,有待进一步研究。2高亲和性钾离子转运蛋白基因TaHAK11的功能研究TaHAK11是属于KT/KUP/HAK转运蛋白家族簇Ⅲ的成员,定位于细胞膜。我们共克隆到三个KaHAK11拷贝,包括JN177的TaHAK11-2及SR3的TaHAK11-3和TaHAK11-5,均定为于小麦2DL上。TaHAK11-5与TaHAK11-2存在一个L50H的变异,TaHAK11-3第50位氨基酸与TaHAK11-2相同；TaHAK11-3与TaHAK11-2/TaHAK1-5存在P175L、G352D、L398F、V585M四个氨基酸变异,其中前三个氨基酸在TaHAK11-3和其他植物HAK11亚簇成员中完全一样。结合TaHAK11的基因组定位特征,我们推测TaHAK11-3是植物HAK11的直系同源基因,而TaHAK11-2/TaHAK11-5是小麦多倍体进化过程中新产生的HAK11旁系同源基因,而TaHAK11-3在体细胞杂交及渐渗系形成过程中被激活表达。在酵母钾离子吸收缺陷突变体WΔ3中进行的功能互补实验表明,TaHAK11-2和TaHAK11-5介导高亲和性的K+吸收,而TaHAK11-3介导低亲和性的K+吸收；TaHAK11-3亲和性的改变与V585M的变异密切相关。TaHAK11-3在小麦地上部分表达量较高,而根中表达量较低；NaCl、PEG及外源ABA处理下,TaHAK11-3在叶中下调表达,而在根中上调表达。TaHAK11-3启动子-GUS转基因拟南芥的GUS染色显示,TaHAK11-3在叶片和茎中大量表达,而气孔保卫细胞中表达量也较高。钾饥饿条件下,与Col-0相比,TaHAK11-3过表达拟南芥叶片受损伤程度更严重。TaHAK11-3过表达降低了负责根中高亲和性K+吸收的AtHAK5的表达量,而提高了负责地上部K+外排的AtKUP2、AtKUP6、AtKUP8、AtGORK以及参与K+从地上部回流到根的AtAKT2的表达量。结果表明,TaHAK11-3通过限制根中K+吸收,增加地上部分K+外排以及增强K+通过韧皮部的回流降低对钾饥饿的耐受性。TaHAK11-3过表达提高拟南芥的抗旱性。与Co1-0相比,TaHAK11-3过表达系气孔开度减小,气孔保卫细胞K+外排相关基因AtKUP6、AtKUP8和AtGORK及ABA合成途径关键酶AtABA1、AtABA2的表达明显上调,而ABA信号通路抑制基因AtAB11表达则明显下调。结果显示,TaHAK11-3通过促进ABA合成和信号途径以及保卫细胞钾离子外排,降低气孔开度来提高拟南芥的抗旱性。