论文部分内容阅读
黄酮类化合物是一类具有抗炎、抗癌、抗高血压、抗糖尿病等多种药理活性的化合物,大部分以糖苷形式存在于植物体内,仅有小部分以游离苷元形式存在。相比于黄酮糖苷类成分,黄酮苷元的脂溶性更好,更易被人体吸收,生物利用度更高。研究表明,绝大多数黄酮类化合物的药理活性主要来源于黄酮苷元。因此,为了得到更多的活性苷元,充分利用黄酮类化合物的药理活性,人们开展了黄酮糖苷类化合物转化为黄酮苷元的研究工作。其中,采用化学转化法和酶转化法对黄酮糖苷类化合物进行结构修饰是研究的热点之一。相比于化学方法,酶转化方法具有专一性强、催化效率高、反应条件温和、无水解副产物产生等优点。在实际生产应用中,酶转化方法受到多种因素的影响,其中,酶促反应溶剂是最重要的因素之一。溶剂不仅可以影响酶促反应速率,溶剂本身的理化性质如极性和pH等还能显著影响酶的活性和稳定性。目前,大多数酶促反应都是在缓冲液或有机溶剂中进行,然而,这些传统的溶剂都不是酶发挥催化活性的最适反应溶剂,有机溶剂甚至会抑制大多数酶的活性。因此,寻找一种合适的酶促反应溶剂是酶转化方法应用于实际生产中亟待解决的问题。低共熔溶剂(DESs)是一类由氢键供体和氢键受体通过氢键作用形成低熔点的共熔物,有良好的生物相容性和广泛的溶解性能,可以提高酶的催化活性和稳定性,在生物催化领域应用前景广阔。因此,本文利用DESs作为新型的酶促反应溶剂,解决酶转化中的酶活性低、底物溶解性差等关键问题,从而应用于黄酮糖苷类化合物的高效转化,期望获得更多的活性黄酮苷元类成分。本研究首先以糖苷酶为对象,研究了酶在DESs中的催化活性和稳定性及其作用机制。随后,利用DESs独特的溶剂性质,开展DESs应用于糖苷酶转化黄酮苷的研究。本文的研究内容主要包括以下三个方面:(1)以氢键供体和受体通过氢键作用形成低熔点的共熔物为理论依据,采用加热法合成了9种不同类型的DESs。采用13C-NMR、1H-NMR、FT-IR、DSC检测方法分析了新型溶剂的形成机制和理化特性,同时探讨了氢键供体和受体两组分之间的相互作用,进一步解释了共熔物的低熔点现象。(2)以DESs为酶促反应溶剂,以β-葡萄糖苷酶为对象,探究了酶在非水介质DESs和水介质DESs(DESs-缓冲液体系)中的催化行为。结果表明,DESs能显著提高β-葡萄糖苷酶的催化活性和稳定性。不同类型DESs对酶催化反应的影响不同,这主要由组成溶剂的氢键供体决定。同时,考察了含水量对DESs与酶蛋白分子相互作用的影响。一定量的水可以降低DESs的黏度,还可以维持酶在DESs中的分子柔性结构。最后,采用酶动力学分析β-葡萄糖苷酶在不同溶剂体系的催化反应,比较了酶动力学参数米氏常数Km、转化数Kcat和最大反应速度Vmax,初步探究了酶促反应的作用机制。(3)以DESs为反应溶剂,以β-葡萄糖苷酶为催化剂,同时首次采用微波辅助技术将黄酮糖苷高效地转化为活性苷元成分。通过响应曲面法优化了酶解黄酮苷的条件,获得最佳的工艺条件为:氯化胆碱:乳酸溶剂(ChCl:LA)(46%,v/v)、pH 4.8、5 mg/mLβ-葡萄糖苷酶、2.2 mM黄酮苷、微波加热(70 W、72°C)反应20 min,此条件下黄芩苷的转化率可达96.63%。本研究以DESs为酶促反应溶剂,提高了β-葡萄糖苷酶的活性和黄酮类化合物的溶解性,并且首次采用微波技术,以DESs为溶剂,利用β-葡萄糖苷酶转化黄酮苷,实现了黄酮类化合物中90%-97%的糖苷成分转化为活性苷元。因此,本研究基于绿色化学理论,为深入研究非水相酶催化提供了一定的指导,同时为实际生产应用开辟了新思路和新方法。