许多重要的治疗药物由于极小的水溶性限制了其在临床上的广泛应用,因此开发有效的传递系统是一项十分重要的工作。作为理想的药物传递系统,它必须能够将药物转运至体内特定部位,并在该部位释放其中的药物。同时,载体本身应无毒或能够降解为无毒产物并从体内消除。两亲性共聚物通过自组装形成的聚合物组装体作为新一代药物传输系统近年来备受研究人员的青睐,广泛用于小分子药物、多肽、蛋白以及基因等治疗药物的传输。近年来合成化学的发展大大推动了智能型聚合物胶束的设计、制备,这些系统能够靶向特异的病灶部位并在外部刺激作用下释放药物。到目前为止,已有6个以上聚合物纳米组装体系统作为抗癌药物的纳米给药系统正在进行临床研究,其中涉及的抗癌药物有阿霉素、紫杉醇及喜树碱等药物。不过,聚合物组装体作为疏水药物的传输系统,具有载药量较低的缺点,直接影响其后期治疗效果、甚至正常疗效的发挥。一般而言,难溶性药物通过疏水作用包封于聚合物组装体的疏水微区,这种药物/聚合物分子间单一的非共价键力是导致药物负载量较低的主要原因。为了解决该类药物传输系统所面临的这一问题,本课题提出通过聚合物和药物间的多重非共价键作用可以提高聚合物纳米组装体的药物负载性能这一假设。为了验证该假设,本研究设计、合成了β-环糊精键合聚乙烯亚胺(PEI-CD),并选用吲哚美辛(IND)作为模型药物。由于PEI-CD同时含有伯胺、仲胺、叔胺及β-环糊精单元,该材料与吲哚美辛之间同时存在静电、氢键及主客体相互作用。此外,药物分子本身的疏水基团介导的疏水作用也有利于高效药物负载系统的构建。通过对甲苯磺酰氯单取代β-环糊精(6-Monotosylβ-cyclodextrin)与聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)之间的亲核取代反应来合成PEI-CD。聚合物PEI-CD的结构通过红外光谱(FT-IR)和核磁共振光谱(1H-NMR)来确定。聚合物组成,即聚合物中β-CD取代量,通过1H-NMR测定来计算得到。在此基础上,通过PEI-CD和IND之间的多重非共价键相互作用构建了壳-核型纳米组装体,作为高效药物传输系统,其中多重非共价键作用主要包括静电作用、氢键、主客体相互作用以及疏水作用。采用改良的透析法来制备IND/PEI-CD纳米组装体。扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)对不同投药比制备的组装体的形态进行观察。药物与聚合物之间的非共价键相互作用通过红外光谱(FT-IR)、核磁共振光谱(NMR)进行表征。药物分子在组装体中的存在形式通过差示扫描量热法(DSC)、X-射线衍射法(XRD)测定和激光共聚焦显微镜(CLSM)进行观察。紫外分光光度法测定吲哚美辛载药量和包封率,表明其载药量最高可达到71%。此外,PEI-CD与含有羧基的其他疏水性药物,如布洛芬、二氟尼柳、氟比洛芬和萘普生等也能自发形成纳米组装体系统,载药量可达到50%以上。选用环氧乙烷/环氧丙烷共聚物和聚乙二醇-聚(L-乳酸)共聚物进行的对照实验表明,环氧乙烷/环氧丙烷共聚物胶束系统的载药量最高仅为22.9%,而聚乙二醇-聚(L-乳酸)共聚物胶束系统的载药量最高为18.9%。体外释放动力学研究显示,IND/PEI-CD自组装体在pH 7.4的释放介质中24 h内可释放90%;模拟胃肠道环境中,在胃液(pH 1.2)中IND释放量极少,而转移至模拟肠液(pH 7.4)中后,药物在24 h内仍能释放90%以上,与此相比,相同条件下原料药仅能释放22%。大鼠灌胃给药后,IND/PEI-CD纳米组装体系统能维持药物较高的浓度长达4天,且其血药浓度-时间曲线下面积(AUC)是原料药组的9倍。方法1.β-环糊精键合聚乙烯亚胺的合成通过对甲苯磺酰氯单取代β-环糊精(6-Monotosylβ-cyclodextrin)与聚乙烯亚胺(PEI)之间的亲核取代反应来合成β-环糊精键合PEI,即PEI-CD。2.聚合物结构表征和组成测定聚合物的结构通过核磁共振光谱(1H-NMR)来确定。聚合物组成,即聚合物中β-CD取代量,通过1H-NMR测定来计算得到。3.药物/PEI-CD组装体微粒的制备采用改良的透析法制备载药组装体纳米微粒。具体而言,将溶于水溶性有机溶剂中的药物溶液在超声作用下加入PEI-CD(10 mg/ml)水溶液中,得到的混合体系在水溶液中透析即可得到载药组装体水溶液。其中涉及的药物包括吲哚美辛、萘普生、二氟尼柳、布洛芬和氟比洛芬。4.载药组装体中药物含量的测定精密称取一定量的载药组装体,将其分散于3 ml乙醇溶液中,涡旋1 min后于8000 rpm离心10 min,之后取出上清,如此重复3次后将上清液合并至10 ml容量瓶中定溶,一定波长处测定其吸光度。吲哚美辛、萘普生、二氟尼柳、布洛芬和氟比洛芬测定波长分别为310 nm、271 nm、306 nm、273 nm、287 nm。按以下公式分别计算载药量与包封率。载药量(%)=组装体中所含药物量(mg)×100%组装体总量(mg)包封率(%)=载药量(%)×100%理论载药量(%)5.药物-聚合物间多重相互作用的表征将药物、聚合物、药物聚合物物理混合物、载药组装体分别进行红外光谱(FT-IR)和核磁共振光谱(NMR)测定,以分析其多重相互作用力的存在。6.载药组装体形态学及表面电位测定采用透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)及原子力显微镜(AFM)来观察微粒形貌。动态光散射法(DLS)测定载药组装体的粒径大小。表面电位分析仪测定载药组装体表面所带电荷情况。7.载药组装体中药物存在形式的表征通过差示扫描量热仪(DSC)和X-射线衍射仪(XRD)测定以及激光共聚焦显微镜(CLSM)观察,分析载药组装体中药物的存在形式和分布行为。8.载药组装体的表面修饰通过在组装体中引入金刚烷基末端改性的聚乙二醇(PEG-Ada)实现其表面的PEG化,提高胶体稳定性和再分散性。将溶于DMSO中的IND溶液在超声作用下加入含有PEI-CD和PEG-Ada的水溶液中,得到的混合液在水溶液中透析即可得到表面PEG修饰的载药组装体。9.体外药动学研究取0.5 ml载药组装体水溶液进行体外释放实验,同时称取一定量的吲哚美辛原料药、片剂作为对照。释放分别在两种不同的介质中进行:1)pH 7.4的PBS缓冲液;2)模拟口服后胃肠道环境在pH 1.2和pH 7.4中进行。计算累计释放百分率,并绘制药物累积释放曲线。10.体内药动学研究大鼠灌胃给药后,预定时间点采集血样,3000 rpm离心10 min取血浆。血浆处理方法为,50μl血浆中加入100μl乙腈和400μl甲灭酸内标液(乙腈为溶剂)后涡旋1 min,8000 rpm离心10 min后取上清,氮气下吹干后加入100μl流动相涡旋1 min后进样,通过HPLC测定药物浓度。流动相为乙腈-6μM H3PO4水溶液(55:45,v:v),流速1 ml/min,柱温40℃,检测波长245 nm,进样量20μl,色谱柱采用C18反相柱。使用DAS软件处理药物浓度数据。11.载药组装体在肠道内滞留时间及其对胃肠道刺激研究使用荧光标记聚合物FITC-PEI-CD制备IND载药组装体,大鼠灌胃给药后,预定时间点将其处死取胃肠道组织。HE染色后显微镜下观察胃肠道刺激情况,荧光显微镜下观察载药组装体在肠道内的滞留情况。结果1.通过1H-NMR分析证明成功合成了预先设计的具有伯胺、仲胺、叔胺和β-环糊精单元的亲水性聚合物PEI-CD。基于1H-NMR进行计算表明,PEI-CD中乙烯亚胺结构单元与β-CD基团的摩尔比为15.2:1。2.通过药物/PEI-CD间多重非共价键作用来构建的纳米微粒,其IND负载量可高于71%,包封率均在90%以上。而萘普生、二氟尼柳、布洛芬和氟比洛芬的载药量均高于50%。3.红外光谱和核磁共振光谱表明药物聚合物间存在多重相互作用,即主客体相互作用、氢键、静电作用及疏水作用。4.组装体微粒的形态观察及粒径测定表明制备的组装体微粒为粒径小于200 nm的球形粒子,表面电位测定表明组装体表面带有正电荷。5.通过DSC和XRD检测和CLSM观察表明,组装体中药物以无定形态存在,且药物分子均匀分散于组装体内,没有IND晶体存在。6.通过透射电镜观察PEG表面修饰的IND/PEI-CD/PEG-Ada组装体,表明均为球形粒子,且分散良好。7.在pH 7.4的PBS中,组装体微粒中负载的IND可以快速释放;模拟胃肠道pH环境进行的释放实验证明,在酸性条件下,IND的释放量极少,而在中性pH条件下,IND可以较快的释放;与原料药和市售片剂相比,组装体微粒中IND的释放大大加快。8.体内药动学实验结果表明,大鼠灌胃给药后,血药浓度可以维持4天以上,IND纳米组装体的AUC是原料药组的9倍。9. IND/PEI-CD载药组装体可在肠道内停留长达36 h,与原料药组相比,IND/PEI-CD组装体的胃肠道刺激性显著降低。结论1.通过对甲苯磺酰氯单取代β-环糊精与聚乙烯亚胺之间的亲核取代反应成功合成了具有伯胺、仲胺、叔胺和β-环糊精单元的亲水性聚合物PEI-CD。2.含有羧基的疏水性药物与PEI-CD间的多重非共价键作用可以介导核-壳型载药组装体的形成;与传统的仅通过疏水作用形成的载药胶束相比,本研究制备的纳米组装体系统具有更高的药物负载能力。从而证实了本课题提出的假设,即通过载体材料和药物分子之间的多重非共价键作用可以制备高载药组装体纳米系统。3. IND/PEI-CD自组装纳米微粒经表面PEG修饰后可使组装体在水溶液中的胶体稳定性和再分散性大大提高。同时,这一组装体可以作为其他疏水性药物的纳米传输系统。4.该类组装体微粒中所负载的药物可以快速释放,因此能大大加快药物的溶出,有利于提高其口服生物利用度。通过组装体微粒能够显著降低药物对胃肠道的刺激性,且组装体在肠道内的滞留时间较长。IND/PEI-CD组装体表面带有正电荷,有望作为某些生物大分子如基因体内给药的载体材料。