随着水产集约化养殖的高度发展,环境污染、高蛋白、高脂肪或霉变饲料的使用,以及抗生素和杀虫剂的滥用均可导致鱼类肝脏受损,破坏肝细胞的正常功能,导致肝细胞破裂,肝组织发生病变,肝脏功能下降,最终导致鱼类的死亡。研究证实,在多种肝病的肝细胞损伤中,多种酶、自由基以及脂质过氧化反应均发生较大的变化;同时,肝损伤发生发展过程中,一系列的细胞因子被激活,既能直接损伤肝细胞,又可通过诱生炎性介质间接产生毒性作用,在疾病的进程中发挥了重要的作用。目前,各种抗生素、杀虫剂和抗病毒药物都不能有效地控制鱼类肝病的发生。因此,利用具有生物学活性的肝损伤模型,快速而高通量地筛选护肝药物并探索其作用原理具有重要意义。动物模型的建立方法有很多,如用四氯化碳(CCl4)、异种蛋白、乙醇、二甲基亚硝胺、复合因素致肝纤维化模型等。其中CCl4是最早、最广泛应用于实验性肝损伤动物模型的选择性肝毒性物质,其成模率高,重复性好,易操作。20世纪60年代后期,中药作为免疫增强剂而引起人们的关注。研究表明中药能调节多种细胞因子,增强机体内抗氧化系统功能,具有良好的抗病毒、抗肿瘤和抗衰老作用。最近10年,中草药已广泛地应用于水产动物的病害防治及其健康养殖中,其天然、毒副作用小、无残留,在鱼类的肠炎防治、免疫力增强方面效果显著。目前,研究发现中草药在防治鱼类肝损伤方面也同样具有良好的效果,并且优势独特,有望在不久的将来成为广为利用的治疗鱼肝病的高效药。本研究构建了CC14诱导的建鲤(Cyprinus carpio.Jian)急性肝(细胞)损伤模型,在此基础上筛选了25种中草药(提取物),并进一步研究了其中三种中草药的保肝作用及联合应用,为开发水产上保肝中药饲料配方奠定理论基础。1.CCl4诱导的建鲤急性肝损伤模型的构建以四氯化碳为肝毒剂,建立建鲤体内外急性肝损伤模型。方法:体内,采用腹腔注射法造模,按 0.1mL/10g 一次性分别注射 0、6.25%、12.5%、15%、18.75%和 25%CCl4-橄榄油溶液(V/V),于造模后24～144h取血,测定建鲤血清中谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)水平;体外,0、2、4、8、16、32mMCCl4分别作用于原代培养的建鲤肝细胞4h,或0、2、4、6、12、24mMCCl4作用于体外培养建鲤精密肝切片(precision-cut liver slices PCLS)4 h,用噻唑蓝(MTT)法检测细胞或PCLS生存状况,同时收集细胞培养上清或切片,测定GPT、GOT、LDH、MDA、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)活力。结果:显示,12.5%、15%CC14-橄榄油溶液腹腔注射建鲤24 h后即能引起血清中GOT、GPT和MDA显著升高(P<0.05或P<0.01),15%CCl4溶液造模组48 h能显著提高血清中LDH水平(P<0.05),4个指标均在CCl4作用96 h后恢复到接近正常水平;8～32 mMCCl4作用体外培养肝细胞4h时,细胞上清中GPT、GOT、LDH和MDA含量显著升高、SOD和GSH活力显著下降,肝细胞存活率显著下降,分别为空白对照组的66.29%、54%和37%,且有剂量依赖性;4～24mMCCl4作用4h后,建鲤精密肝切片培养上清液的GOT、GPT、LDH和MDA含量升高,SOD和GSH水平下降,与对照组相比,差异显著(P<0.05或P<0.01),浓度为12mM的CCl4,损伤4h,肝切片的活力维持在65%以上。结论:分别采用15%CCl4-橄榄油,按0.1ml/10g腹腔注射建鲤72 h、8 mM CCl4作用体外培养肝细胞4 h及12mM的CCl4损伤PCLS 4 h可以构建体内外急性肝损伤模型。这为高效大批量筛选保肝中药提供了可能。2.基于CCl4诱导的建鲤肝细胞损伤模型对25味中草药(提取物)的初筛利用构建的CCl4诱导的建鲤急性肝细胞损伤模型对25味中草药(提取物)进行了初筛。方法:采用8mMCCl4作用体外培养肝细胞4h造模,用含有低、中、高剂量中草药(提取物)的L-15培养基进行前处理、前后处理及后处理孵育4h后,通过测定肝细胞活力和细胞培养上清中LDH、GPT、GOT、SOD和GSH-PX等生化指标来观察这25味中草药(提取物)的保肝效果。结果:中草药对CC14诱导的肝细胞损伤的保护作用规律类似,中药能显著抑制CC14导致的细胞增值活性的降低(P<0.05或P<0.01);能显著抑制培养上清中GPT、GOT和LDH活性的升高(P<0.05或P<0.01),显著恢复上清中GSH-PX和SOD水平(P<0.05或P<0.01),抑制MDA生成(P<0.05);中药提取物与CCl4的给予顺序影响着中草药提取物对肝细胞的保护效果,前后处理组对损伤肝细胞的保护效果明显要优于前和后处理组;杜仲提取物的保肝效果不明显。结论:大都数的中草药(提取物)对CCl4诱导的建鲤肝细胞损伤有保护作用,该作用与它们的清除自由基和抗氧化能力有关;中草药提取物对肝损伤的预防作用比治疗作用更重要。3.甘草次酸的保肝作用研究利用CC14诱导的建鲤精密肝切片损伤模型,评价甘草次酸(Glycyrrhetinic acid,GC)对建鲤精密肝切片的抗氧化及缓解炎症反应的效果。方法:采用12 mMCCl4损伤PCLS 4 h造模,用含GC(2.5、5和10μg/ml)和PDTC(4μg/ml)的L-15培养基预孵6h,然后收集肝切片和细胞培养上清,分别测定肝切片活力、培养上清和肝组织匀浆中肝损伤生化酶含量及采用实时定量PCR法和Western blots测定肝组织中核转录因子NF-kB/C-Rel及细胞因子iNOS、IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA表达和蛋白水平的变化。结果:甘草次酸预处理精密肝切片6h能显著抑制CC14的细胞毒性,5和10 μg/ml的甘草次酸能极显著提高切片的增值活性;甘草次酸能缓解CC14诱导的精密肝切片的氧化应激程度,5和10 μg/ml的甘草次酸能显著促进匀浆中SOD、GSH活性水平的恢复(P<0.05),同时极显著抑制MDA合成(P<0.01);5和10 μg/ml的甘草次酸均能显著抑制CC14诱导的NF-kB/C-Rel、iNOS、IL-1β3、IL-6和IL-8等炎症细胞因子的mRNA表达量的升高,也能显著抑制C-Rel的蛋白水平(P<0.05或P<0.01);核转录因子NF-kB抑制剂PDTC(4μg/ml)作用精密肝切片6h后,NF-kB表达量受到显著的抑制(P<0.01),其下游的iNOS、IL-1β、IL-6和IL-8的表达也相应的显著下调,切片的增值活性显著提高(P<0.05或P<0.01),甘草次酸结果与其一致。结论:甘草次酸对建鲤精密肝切片有保护作用,与其抗击炎症和降低细胞毒性作用有关。4.姜黄素的保肝作用研究利用CC14诱导的建鲤体内肝损伤模型,对姜黄素的保肝作用行深入研究。方法:用含姜黄素(0.1、0.5和1.0%)的饲料饲喂鲤60 d,再腹腔注射30%CC14混合液,然后抽血及采集肝组织,分别测定肝指数、肝细胞DNA损伤程度、血清和肝组织匀浆中肝损伤生化酶含量、肝组织病理切片及采用实时定量PCR法测定肝组织中核转录因子NF-kB/C-Rel及细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-12的mRNA表达水平的变化。结果:0.5和1.0%的姜黄素能显著抑制CC14导致的肝指数增大(P<0.05),同时能有效减少肝细胞DNA断片的产生,对肝细胞彗星的慧尾长、尾部DNA百分含量、尾矩及Olive尾炬等损伤指标均有显著改善作用;姜黄素能明显减轻CC14作用导致的肝组织广泛性空泡变性、细胞轮廓不清、核固缩和核溶解等组织学病变;0.5和1.0%的姜黄素能显著抑制CC14诱导的鲤血清中GOT含量升高及促进肝组织匀浆中SOD水平的恢复(P<0.05),而1.0%的姜黄素能显著降低鲤血清中GPT和LDH含量(P<0.05)、显著提高匀浆中T-AOC和GSH水平(P<0.05)、显著抑制MDA合成(P<0.05);0.5和1.0%的姜黄素能显著抑制CC14诱导的NF-kB/C-Rel、IL-1β和TNF-α的表达量的增加(P<0.05),而低、中、高浓度的药物均能显著下调IL-12的表达量(P<0.05);随着姜黄素浓度的增大,肝指数、酶指标、病理切片及细胞因子的mRNA表达均表现出剂量效应。结论:姜黄素对建鲤肝组织有保护作用,其能有效改善肝细胞DNA的损伤程度,调节其抗氧化能力及相关细胞因子的分泌。5.香菇多糖对鲤鱼离体培养免疫细胞的活性调节作用采用Percoll密度离心等技术,对鲤鱼(Cyprinus carpio)的头肾巨噬细胞和外周血白细胞进行分离纯化,并离体培养,来研究香菇多糖对鲤鱼离体培养免疫细胞的活性调节作用。方法:体外暴露不同浓度的香菇多糖后,分别采用MTT法测定它们对鲤鱼外周血白细胞增殖的影响;NBT(nitroblue tetrazolium)还原法和Griess试剂显色法测定对头肾巨噬细胞的呼吸爆发的影响;实时定量PCR法测定头肾巨噬细胞细胞因子IL-1β诱导表达的影响。结果:香菇多糖作用头肾巨噬细胞24 h后浓度为1,10和100 μg/mL时能显著诱导巨噬细胞的氧爆发活性(P<0.05或P<0.01);作用头肾巨噬细胞96 h后,其低浓度对巨噬细胞生成一氧化氮无显著影响,当作用浓度为1000 μg/mL表现出显著的高浓度抑制作用(P<0.01);浓度为100和1000 μg/mL的香菇多糖作用外周血白细胞24 h后,可以显著促进鲤鱼外周血白细胞的增殖(P<0.01),且在作用巨噬细胞24 h后浓度为100 μg/mL能显著增强IL-1β3的体外诱导表达(P<0.01)。结论:香菇多糖对离体培养鲤鱼免疫细胞有明显活性作用,对鲤鱼非特异性免疫和特异性免疫具有促进作用,是一种有潜力的鱼用免疫增强剂。6.姜黄素、甘草次酸和香菇多糖联合对CC14诱导的建鲤肝损伤的保护作用以四氯化碳构建建鲤体内急性肝损伤模型,对姜黄素、甘草次酸和香菇多糖联合护肝作用进行研究。方法:分别用含有姜黄素、甘草次酸、香菇多糖和低、中、高剂量组联合中草药饲料投喂60 d后,各组腹腔注射30%的CC14,注射剂量为每10 g鱼体注射0.05 mL。禁食72 h,以诱导肝损伤。通过测定各组生长指标、血清和肝组中的生化酶及肝组织炎性细胞因子mRNA的表达情况来观察联合用药组的保肝效果。结果:甘草次酸单味用药组及中、高剂量姜黄素+甘草次酸+香菇多糖联合用药组能显著提高建鲤的相对增重率和特定生长率(P<0.05),显著降低饵料系数(P<0.05):与模型组相比,各用药组能显著抑制CC14导致的血清清中GPT、GOT和LDH活性的升高(P<0.01),显著恢复肝组织中GSH和SOD水平(P<0.01),抑制MDA生成(P<0.05或P<0.01),能显著抑制 C-Rel、iNOS、IL-1β、TNF-α、IL-6 和 IL-8 表达量的升高(P<0.05 或P<0.01);与姜黄素、甘草次酸或香菇多糖单味用药组相比较,姜黄素+甘草次酸+香菇多糖联合用药组保肝效果更明显(P<0.05或P<0.01),随着联合用药组剂量的升高,作用愈加显著(P<0.05或P<0.01)。结论:姜黄素、甘草次酸和香菇多糖联合用药后,对CCl4诱导的建鲤肝损伤具有协同放大的保护作用。