本研究以已获得的抗维生素B₁₂(VB₁₂)单克隆抗体的细胞株为基础,采用杂交-杂交瘤细胞融合法制备了抗维生素B₁₂-抗吖啶酯双特异性抗体。在此基础上,建立了相关维生素B₁₂免疫化学发光检测方法,并开展了应用研究,主要研究内容如下:1、吖啶酯人工抗原的制备采用了活性酯法将吖啶酯（AE）半抗原分子与载体蛋白钥孔血蓝蛋白（KLH）和牛血清蛋白（BSA）偶联,经过紫外描和免疫原性鉴定,结果表明成功偶联了免疫抗原AE-KLH和检测抗原AE-BSA。2、电融合法制备抗维生素B₁₂-抗吖啶酯的双特异性抗体通过诱导维生素B₁₂单克隆抗体杂交瘤细胞株,获得了对HAT敏感的次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）缺陷型细胞株。运用电融合技术,将获得的VB₁₂缺陷性细胞株和吖啶酯免疫的小鼠脾细胞融合,筛选获得了对VB₁₂和吖啶酯双阳性的杂交-杂交瘤细胞株,其细胞上清经间接竞争ELISA检测,结果对AE标准品和VB₁₂标准品的半抑制率(IC₅₀)分别为5.90 ng/mL和1.90ng/mL;通过分析计算5株细胞染色体,平均染色体数为147±5条,符合三体杂交瘤的染色体数目。结果表明成功获得了分泌抗维生素B₁₂-抗吖啶酯双特异性抗体的杂交-杂交瘤细胞株。3、基于双特异性抗体的化学发光免疫分析方法的建立利用获得的双特异性抗体建立了检测维生素B₁₂的化学发光免疫分析方法,研究了抗原包被浓度、吖啶酯偶联辣根过氧化物酶的稀释比例、缓冲液的pH和缓冲液中盐离子（Na⁺）浓度分别对化学发光强度（RLU）和半抑制浓度(IC₅₀)的影响,结果最佳反应条件为:抗原包被浓度为8μg/mL、吖啶酯偶联辣根过氧化物酶稀释比例为1:400、抗体稀释缓冲液为pH 7.5的0.01 mol/L的PBS;竞争抑制率曲线的IC₅₀为6.18 ng/mL,线性范围为1-50 ng/mL,最低检测限IC₁₀为0.93 ng/mL。对两种样品进行了三个水平的加标回收实验,其加标回收率分别为94.98%-101.50%和86.11%-102.12%,变异系数为2.37%-4.07%和2.71%-7.75%,分别对三种实际样品进行了检测,其检出值与标签值基本相符。