研究背景与目的:胸腺表达的趋化因子(TECK,CCL25),是一种由小肠上皮细胞、胸腺上皮细胞及髓质树突状细胞表达和分泌的趋化因子,通过与其唯一的受体CCR9结合,对胸腺细胞、淋巴细胞、树突状细胞和活化的巨噬细胞发挥趋化作用。最初,CCR9在调节胸腺细胞定位并促进其发育、成熟以及促进细胞向肠道归巢方面的功能得到了全面的研究。最近的研究表明,正常小肠和肠系膜淋巴结中的CCR9~+T细胞高表达CD69,而且血液循环中的CCR9~+T细胞活化程度高于CCR9-细胞。另外,从外周血和小肠中分离出的CCR9~+T细胞主要表达产生IFNγ的Th1细胞因子谱。Hepatic等先前发现,原发性硬化性胆管炎患者肝脏中有激活的功能性CCR9~+T细胞浸润,这与病变部位(肠外和胸腺外)CCL25的异常高表达有关。CCL25/CCR9还具有授权效应性/记忆性T细胞到达组织的强大功能。CCR9与CCL25的结合还可以抑制CD4~+T细胞向调节性T细胞(Treg)分化。在自身免疫中,CCR9~+辅助性T细胞通过分泌IL-21促进CD8~+T细胞的增殖和存活进而诱导糖尿病。重要的是,患者外周循环血中的CD8~+CCR9~+的初始T细胞与黑色素瘤患者的良好预后和肺转移灶减少有关。在小鼠CCL25转基因肉瘤模型中,给予小鼠CCL25抗体清除体内CCL25可加速肿瘤的生长。因此,我们假设将CCL25递送到肿瘤并释放到细胞间隙,是一种可以增强免疫调节剂抗肿瘤作用的有效策略。多种不同实体瘤(包括三阴性乳腺癌)通过过度表达CD47分子向吞噬细胞传递“不要吃我”的信号,帮助它们逃避免疫系统的监视。用抗体阻断CD47分子可增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬功能,还可促进树突状细胞启动T细胞依赖的抗肿瘤免疫反应。然而,由于CD47分子也在红细胞、血小板等造血系统来源的细胞和其他正常细胞表面表达,CD47抗体全身给药后会影响正常细胞功能,并导致贫血、中性粒细胞减低等副作用的发生。利用纳米载体递送靶向CD47的小干扰RNA(siCD47)被证明可以有效抑制黑色素瘤的原位生长和肺转移并降低副作用。然而,向肿瘤靶向递送基于RNA的癌症治疗药物仍然是一个挑战。两种不同机制的治疗方法相结合已被证明能够协同作用阻止癌症的发展,为肿瘤治疗提供了一种有希望的策略。以纳米技术为基础的递送系统可以利用物理作用包载不同种类的抗肿瘤药物,通过高通透性和滞留效应(EPR)改善了药物的药代动力学和生物分布特征,从而潜在地提高抗癌效果。然而,应注意的是,趋化因子CCL25和CD47 si RNA的物理性质是非常不同的,到达肿瘤组织后它们应分别被释放在细胞外和细胞内。为了获得令人满意的疗效,一个理想的基于纳米技术的全身给药系统应具有许多特性,主要包括:(1)促进药物在肿瘤中的富集;(2)趋化因子快速而充分地释放在细胞外;(3)si RNA的释放和细胞内化。因此,我们迫切需要设计一种新型的药物传递系统,该系统应满足上述所有特性,以增强TNBC的免疫治疗效果。研究方法:1.建立小鼠的原位三阴性乳腺癌(4T1)模型,利用免疫组化和流式的方法检测人和小鼠三阴性乳腺癌中是否表达CCL25和CCR9。2.合成包载siCD47和CCL25的肿瘤酸敏感的纳米颗粒NP-siCD47/CCL25。3.通过流式细胞术(FC)、激光共聚焦荧光显微镜(LSCM)呈像和实时定量PCR(q PCR)、蛋白质印迹(WB)等方法检测在体外中性和弱酸性条件下细胞对siCD47和CCL25的摄取,以及siCD47的沉默效率。4.利用小动物呈像、LSCM呈像和免疫组化方法检测siCD47和CCL25的体内及瘤内分布。5.通过流式细胞术和免疫组化等方法进一步检测在体内CCL25对肿瘤免疫微环境的影响和肿瘤细胞CD47的表达。6.观察静脉注射NP-siCD47/CCL25对4T1肿瘤原位生长和远处转移的影响并利用流式细胞术检测了抗肿瘤的免疫反应机制。观察NP-siCD47/CCL25对PD-1/PD-L1抗体治疗效果的影响。研究结果:1.TNBC和健康人外周血单个核细胞中CCR9~+T细胞的比例较低且无明显差异。人TNBC组织和小鼠4T1肿瘤组织不表达CCL25。人TNBC组织不表达CCR9,小鼠4T1的TILs中CCR9~+细胞比例较低。CCR9~+T细胞中活化细胞的比例明显高于CCR9-T细胞。2.在体外中性条件下,标记siCD47和CCL25的荧光信号共定位。酸性条件下,两者分离。4T1细胞对siCD47的吞噬在弱酸性条件下强于中性条件。酸性条件下siCD47的沉默效率高于中性条件。3.在体内,颗粒将CCL25释放在肿瘤间质细胞外,并募集CCR9~+CD8~+T细胞进入肿瘤组织。而siCD47进入肿瘤细胞,降低了肿瘤细胞表面CD47的表达。4.NP-siCD47/CCL25能延缓原位4T1肿瘤形成并抑制已形成的肿瘤组织生长。全身给药后,颗粒能够抑制4T1肿瘤细胞的肺转移。而NP-siCD47或NPsi NC/CCL25单药没有作用。5.NP-siCD47/CCL25抗肿瘤作用依赖于T细胞的作用,颗粒能够减少肿瘤组织中骨髓来源的抑制细胞(MDSCs),增加CD8~+T细胞浸润。6.NP-siCD47/CCL25能逆转PD-1/PD-L1抗体耐药,而PD-1/PD-L1抗体能增强NP-siCD47/CCL25的抗肿瘤作用。NP-si NC/CCL25单药即可以逆转PD-L1抗体耐药。研究结论:1.CCR9~+CD8~+T细胞表现为活化的细胞表型,但在三阴性乳腺癌组织中浸润的数量有限。人和小鼠的4T1三阴性乳腺癌组织不表达CCR9的配体CCL25。2.肿瘤酸敏感的纳米颗粒NP-siCD47/CCL25在体内可以募集CCR9~+CD8~+T细胞浸润到肿瘤组织,同时降低肿瘤细胞CD47表达。3.NP-siCD47/CCL25抑制4T1肿瘤形成、生长和远处转移的作用依赖于CD8~+T细胞介导的抗肿瘤免疫反应。4.NP-si NC/CCL25可以逆转PD-L1单抗耐药,NP-siCD47/CCL25和PD-1/PD-L1单抗协同作用,显著增强了4T1肿瘤的免疫治疗作用。