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目的及背景:近年来越来越多的临床研究表明对于一线使用表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)耐药后的病人,联合使用抗血管生成药能显著延长患者疾病的无进展期。肿瘤新生血管的出现与肿瘤的进一步生长、侵犯周边组织器官及远处转移均有着密不可分的关系。而抗血管生成药物能够有效地抑制肿瘤的新生血管形成,通过阻断肿瘤细胞的营养供应,破坏肿瘤微环境,从而抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭。相关体外实验表示:血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)不仅表达于血管内皮细胞,也可在肺腺癌细胞中表达,而且肿瘤细胞能自分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),这就表示抗 VEGF 对肿瘤细胞存在直接的抑制作用。EGFR和VEGFR存在共同的下游信号通路,抑制EGFR的同时也能抑制VEGF的分泌,两者联合使用可以同时抑制EGFR和VEGFR两条信号通路,达到增强药物的抗肿瘤作用。所以对使用一代EGFR-TKI后出现耐药的患者,加用抗血管生成药物进行治疗或许可以成为新的治疗手段。本文旨在体外研究抗血管生成药物对EGFR-TKI耐药非小细胞肺癌增殖的影响,血管拟态的形成及相关蛋白分子的变化,探讨上述药物联合在EGFR-TKI耐药细胞株中的抗肿瘤作用及机制。方法:(1)以EGFR 19外显子缺失的肺腺癌细胞株PC-9和HCC827细胞为亲本株,使用吉非替尼长期低剂量诱导形成PC-9GR和HCC827GR细胞株,PC-9GR携带T790M 突变,HCC827GR 无 T790M 突变,H-1975 带有 EGFR 21 外显子 L858R 点突变和T790M突变;(2)以PC-9GR、H-1975、HCC827GR为实验对象,设立阴性对照组(未给药组)、阳性对照组(吉非替尼单药组、AZD 9291单药组、安罗替尼单药组、贝伐珠单抗单药组)和实验组(安罗替尼联合吉非替尼组、安罗替尼联合AZD 9291组、贝伐珠单抗联合吉非替尼组、贝伐珠单抗联合AZD 9291组);(3)用CCK-8方法检测各细胞株对抗血管生成联合EGFR-TKI及两者单独应用的IC50值;(4)通过CompuSyn软件计算不同细胞株在抗血管生成联合EGFR-TKI方案中的联合指数(CI值)来判断联合用药方案的的作用效果;(5)通过血管拟态方法观察各细胞在抗血管生成联合EGFR-TKI及两者单独应用的方案中对血管拟态形成的影响;(6)通过western blot方法检测各细胞株中在单药及联合方案中涉及抗血管生成信号转导途径的分子改变,如:p-FGFR、Akt、p-Akt、Erk、p-Erk,探究抗血管生成药物对EGFR-TKI耐药非小细胞肺癌细胞的抗肿瘤作用机制。结果:(1)在三种耐吉非替尼的肺腺癌细胞株中,安罗替尼和贝伐珠单抗对EGFR突变阳性肺癌细胞有抑制作用。安罗替尼和贝伐珠单抗联合吉非替尼能逆转耐药肺癌细胞对吉非替尼的耐药性,安罗替尼和贝伐珠单抗联合AZD 9291能增强药物对耐药肺癌细胞的抗肿瘤活性;(2)高浓度的安罗替尼和贝伐珠单抗联合吉非替尼对PC-9GR和H-1975的抑制作用优于低浓度的安罗替尼和贝伐珠单抗联合方案,差异有统计学意义(p<0.05);在HCC827GR细胞中,吉非替尼联合不同浓度贝伐珠单抗对细胞的抑制作用无明显差异。高浓度的安罗替尼和贝伐珠单抗联合AZD 9291对PC-9GR、H-1975及HCC827GR的抑制作用优于低浓度的安罗替尼和贝伐珠单抗的联合方案;(3)安罗替尼和贝伐珠单抗分别联合吉非替尼及AZD 9291对抑制EGFR突变肿瘤细胞的增殖具有协同作用,且这种协同作用与药物的剂量之间存在剂量依赖性;(4)在体外实验中,安罗替尼和贝伐珠单抗分别联合吉非替尼和AZD 9291能抑制PC-9GR和HCC827GR细胞的血管拟态形成,但对H-1975细胞的血管拟态形成无明显抑制作用;(5)安罗替尼和贝伐珠单抗联合吉非替尼和AZD 9291时能使PC-9GR、H-1975及HCC827GR细胞株中p-Akt的表达降低。安罗替尼联合吉非替尼和AZD 9291能使PC-9GR和H-1975细胞中p-Erk表达下降。在HCC827GR细胞中,安罗替尼和贝伐珠单抗分别联合吉非替尼和AZD 9291对p-Erk的表达均无影响。总结:抗血管生成药物与分子靶向药物的联合应用可以降低吉非替尼耐药肺癌细胞的耐药性,提高AZD 9291的抗肿瘤活性。安罗替尼和贝伐珠单抗联合吉非替尼及AZD 9291可以抑制EGFR突变阳性肺癌细胞的增殖,两者具有协同作用,且协同作用与抗血管生成药物和分子靶向药物的剂量之间存在着剂量依赖性。研究提示,安罗替尼和贝伐珠单抗对于具有第19外显子缺失的肿瘤细胞有着较好的抑制血管的作用。安罗替尼联合吉非替尼和AZD 9291能通过抑制Akt和Erk信号通路来抑制T790M阳性肺癌细胞增殖。在T790M突变阴性的肺癌细胞中,安罗替尼和贝伐珠单抗分别联合吉非替尼及AZD 9291主要通过抑制Akt信号通路来抑制肺癌细胞的增殖。