在实时原位分析中,单粒子示踪技术是分析许多生物过程以及判断生物体的组织构架的强有力手段。金纳米颗粒凭借其独特的光学特性,而且耐光漂白,使其能够在重要的生物学过程中长时间示踪分析。而细胞内的生命活动或者功能构架都是在三维空间内展开的,并且很多亚细胞结构都在微米到纳米尺度,光学衍射极限的存在限制了我们使用光学显微镜观察这些生物样品,因此发展可行的高分辨三维成像技术用来研究生命活动的机制和功能尤为重要。基于此,本论文以金纳米颗粒为探针,利用暗场光学显微镜作为成像系统,开展一系列工作,包括:在第2章中,为了提高单粒子示踪技术在轴向的定位精度,我们建立了以金纳米颗粒为探针的三维超分辨单分子显微成像技术,通过在暗场显微镜的光路中引入一个长焦距的平凸柱面镜来打破光学系统的轴对称性,从而产生x、y轴向上的光程差,即可以从二维的散光信息中提取三维空间位置的信息编码。进一步应用这种方法定位了在细胞膜外基质(PCM)以及细胞膜层上金纳米颗粒的z轴位置,然后从轴向定位分布中,我们获得了PCM层的大致厚度为5.35μm,为进一步研究纳米颗粒和细胞膜外基质的相互作用奠定了基础。在第3章中,基于我们之前的三维超分辨单分子显微成像技术实现了横向为28-36 nm和轴向为68 nm的空间分辨率以及13 Hz的时间分辨率。改进的空间分辨率很适用于三维示踪,而且它的时间分辨率达到了实时分析细胞内吞过程的要求,因此我们详细记录了细胞穿膜肽修饰的金纳米颗粒从细胞膜表面通过跨膜运动最后深入到细胞质内的全过程,并且首次揭露了细胞穿膜肽修饰的金纳米颗粒的内吞速率,可帮助我们了解细胞穿膜肽运载货物背后详细的机理步骤。在第4章中,我们提出了一种基于颜色分析技术的金纳米棒空间角度取向检测的方法,即根据单个金纳米棒在不同偏振角度下的散射光信号颜色变化,利用暗场偏振成像技术推断金纳米棒的空间取向。通过转动偏振片方向来改变与金纳米棒之间的夹角,从而得到一系列偏振角度对应散射光颜色的关系,发现不同偏振角度下散射光的颜色强度值是角度的余弦平方函数。随后我们在甘油溶液中实时监测了单个金纳米棒的旋转运动,进一步运用到研究细胞内单个金纳米棒的旋转行为,该种方法对研究偏振依赖的纳米材料以及纳米尺度上生物分子的旋转运动行为等具有重要的意义。