目的：本项目通过分离新鲜和冻融豚鼠卵巢腔前卵泡的体外发育，比较培养方式、培养液成分、卵泡入培直径和冻融过程对其存活率、成腔率、生长速度的影响，以探讨豚鼠腔前卵泡的体外培养体系的优化，期望为年轻高治愈率肿瘤患者冷冻保存卵巢组织内腔前卵泡的将来临床应用提供理论和实验依据。　　方法：本研究采用酶消化结合机械分离法分离豚鼠卵巢腔前卵泡随机分组进行体外培养(除2组3组以外，其他均采用0.5％藻酸盐微球包埋卵泡置于含0.1IU/mlFSH的a-MEM培养液中三维培养)，比较(1)藻酸盐微球包埋卵泡三维培养和二维常规培养；(2)不同浓度藻酸盐微球包埋卵泡三维培养；(3)添加不同浓度FSH培养液三维培养；(4)单个卵泡和多个卵泡三维培养；(5)腔前卵泡体外培养初始直径；(6)冻融过程等对豚鼠腔前卵泡体外发育的影响，分别于培养0天(D0)、4天(D4)、8天(D8)和12天(D12)在倒置显微镜下观察卵泡形态，卵母细胞与卵泡细胞分离情况，成腔率、OCTAX Eyeware软件测量卵泡和卵母细胞直径变化等情况，D12采用LIVE/DEAD荧光染色共聚焦显微镜观察其存活率。　　结果：所有分离的腔前卵泡DO随机分组体外培养，各组卵泡初始直径均值无显著差异(P>0.05)。　　1、藻酸盐三维培养和二维常规培养组比较：体外培养的腔前卵泡直径逐渐增加，d12卵母细胞直径藻酸盐三维培养组(75.63±6.34um)比较二维培养组(71.03±6.45um)差异有统计学意义(P<0.05)；d12卵母细胞存活率藻酸盐三维培养组(76.8%)比较二维培养组(56.4%)有显著性差异(P<0.05)；d12藻酸盐三维培养组卵泡三维结构保存完好，而二维培养组有66.96%卵泡发生了卵母细胞与颗粒细胞分离。　　2、不同藻酸盐浓度(0.5%、1%、2%)微球包埋三维培养组比较：体外培养各时间段(D4、D8、D12)的三组(0.5%、1%、2%藻酸盐组)卵泡直径分别为D4组(357.53±52.79um；342.50±53.93um；332.01±65.03um)、D8组(416.33±86.02um；394.91±82.67；382.88±88.28um)、D12组(447.26±115.54um；427.41±127.01um；432.68±140.77um)，比较均无统计学意义(P>0.05)，但体外培养12天后卵泡三维结构完整性卵泡数在低浓度(0.5%)藻酸盐微球包埋组中最高(88.99%)，仅11.11%卵泡生长失去球形结构，而1%藻酸盐组有23.46%的卵泡失去球形结构，2％藻酸盐组有52.81％的卵泡失去球形结构；而D12成腔率(23.95％，20.63％，23.19％)、D12卵泡存活率(93.33％，90.00％，87.50％)、卵母细胞存活率(76.8％，68，09％，64，41％)，3组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。　　3、不同浓度FSH组之间的比较：对照组无添加FSH即0IU/mlFSH组卵泡生长缓慢，卵泡直径在D4、D8、D12(245.33±52.68um；266.59±86.95um；295.19±134.07um)分别与0.01IU/mlFSH组(342.70±69.29um；396.54±100.18um；413.01±141.77mn)、0.1IU/mlFSH组(357.53±52.79um；416.33±86.02um；447.26±115.54um)和1IU/mlFSH组(342.51±62.04um；413.97±99.67um；446.55±121.33um)比较差异均有统计学意义(P<0.05)；D12成腔率对照组为(2.63％)，分别与各实验组(0.01IU/mlFSH组、0.1IU/mlFSH组和IIU/mlFSH组)卵泡成腔率(26.32％，23.95％，26.19％)比较，均有统计学差异(P<0.05)。而各实验组(0.01IU/mlFSH组、0.1IU/mlFSH组和1IU/mlFSH组)之间在D4、D8、D12的卵泡直径和成腔率差异均无统计学意义(P>0.05)；D12卵泡存活率，0IU/mlFSH组(66.07％)与0.1IU/mlFSH组(93.33％)、1IU/mlFSH组(96.00％)比较，差异有统计学意义(P<0.05)；0.01IU/mlFSH组(81.48％)与1IU/mlFSH组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，其他各组之间差异无统计学意义(P>0.05)；D12卵母细胞存活率，各组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。　　4、单个卵泡培养和多个卵泡培养组：单个卵泡组(346.03±61.05um；401.39±93.69um；430.66±121.70um)和3个卵泡组(344.54±74.89um；408.30±116.72um；437.74±157.05um)体外培养在D4、D8、D12分别比较，卵泡直径差异无统计学意义(P>0.05)，卵泡群培养D12成腔率(37.35％)高于单独培养(23.95％)，差异有统计学意义(P<0.05)，D12卵泡存活率(91.67％，93.33％)、D12卵母细胞存活率(70.18％，76.8％)，两组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。　　5、腔前卵泡体外培养初始直径(<160um、160-220um、>220um)比较：体外培养12天，初始直径160-220um卵泡组平均直径(281.76±106.30um)增长最快，与其他两组(165.99±88.75um，184.88±113.04um)相比，差异有统计学意义(P<0.05)，，<160um组与>220um组之间差异无统计学意义(P>0.05)；D12成腔率，<160um组没有成腔卵泡，与160-220um组(281.76±106.30um)，>220um组(184.88±113.04um)之间差异有统计学意义(P<0.05)，160-220um组与>220um组之间差异无统计学意义(P>0.05)。D12卵泡存活率(90.00％，92.86％，100％)、卵母细胞存活率(70.37％，85.54％，20.00％)，两组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。　　5、新鲜组和冻融组比较：冻融组分离得到的腔前卵泡数量(98个/卵巢)，少于新鲜组的得卵数(122个/卵巢)，差异有统计学意义(P<0.05)。冻融组卵泡生长缓慢，卵泡直径在D4(308.89±55.37um)、D8(337.96±74.24um)、D12(339.29±77.91um)与新鲜组(357.53±52.79um、416.33±86.02um、447.26±115.54um)相比，差异均有统计学意义(P<0.05)；与新鲜组(23.95％)比较D12冻融组成腔率低，只有1个成腔，占1.69％；冻融组卵泡存活率(80.49％)比新鲜组(100％)也较低，差异均有统计学意义(P<0.05)，卵母细胞存活率(36.59％，76.8％)，两组之间差异均有统计学意义(P<0.05)。　　结论：　　1、藻酸盐微球包埋腔前卵泡三维培养优于二维常规培养法。能够较好维持卵泡的立体结构完整性更有利于卵母细胞的生长，且藻酸盐浓度以0.5％为佳。　　2、豚鼠腔前卵泡体外培养添加FSH有利于提高卵泡的生长速度、存活率和成腔率。　　3、不同的藻酸盐包埋浓度不影响卵泡的生长速度、存活率和成腔率，但高浓度的藻酸盐包埋浓度会使卵泡失去球形结构。　　4、多个卵泡共同培养有利于提高豚鼠腔前卵泡的成腔率。　　5、直径160-220um的腔前卵泡更适合三维体外培养，具有更高的生长速度和成腔率。　　6、冻融过程致豚鼠腔前卵泡一定程度损伤，导致分离腔前卵泡数量减少，体外培养卵泡存活率、成腔率下降。