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小曲清香型是我国清香型白酒的重要组成,小曲白酒微生物具有与中国大曲酒不同的酿造特征。开展对小曲白酒生产中微生物的功能、组合发酵中的相互作用的研究,不仅对于丰富我国白酒微生物学的研究具有重要意义,而且对于小曲白酒的传统技术的改造和提升都有积极的现实价值。本研究通过细菌的16S rRNA V3区、酵母的26S rRNA D1区和真菌的18S rRNA编码基因,应用变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis, PCR-DGGE)技术比较分析了小曲清香型白酒的小曲和酒醅中细菌、酵母和霉菌的群落组成。结合可培养与分子生物学手段,确定了小曲清香型白酒中主要功能微生物;在明确主要功能微生物的生理代谢特性的基础上,液态条件下摸索不同菌种之间的相互代谢抑制情况;最后在固态条件下实现霉菌和酵母的组合发酵,在保证酒精发酵效率的同时适当地提高酒中酯类的含量。主要研究结果如下:1)首次将PCR-DGGE技术应用到小曲清香型白酒,分析其中的微生物群落结构及变化规律。小曲酒中细菌的种类较多,主要以乳酸菌和芽孢杆菌属为主。酵母类主要包括Saccharomycopsis fibuligera、Pichia anomala和Saccharomyces cerevisiae;霉菌种类相对较少,主要以Rhizopus oryzae为主;不同季节酒醅中微生物生长和消亡规律存在着差异,但微生物组成无明显变化。结合酒醅平板计数结果,可确定S. cerceisiae和P. anomala是清香型小曲酒中主要的酒精发酵和产酯酵母。2)在高粱汁培养基中,P. anomala生长较为缓慢,需要近乎10 h的生长间隔才能达到与S. cerevisiae相同的生长量;随着乙醇浓度的增加,两株酵母的发酵能力都下降,且S. cerevisiae耐受酒精的能力大于P. anomala;相比GPYM、YPD培养基,P. anomala在高粱汁培养基中具有较好的产乙酸乙酯能力;提高P. anomala的接种量,在发酵前期能明显提高乙酸乙酯含量,但后期乙酸乙酯含量下降迅速,发酵结束发酵液中乙酸乙酯浓度无差异。3)将S. cerceisiae和P. anomala在高粱汁培养基中进行混菌发酵。采用顺序接种混菌发酵方式,可避免S. cerevisiae对P. anomala的生长抑制,使两种酵母均能获得较高的生物量;发酵结束时,乙醇浓度为20.17 g/L,比S. cerevisiae单菌种发酵时降低了9%。但乙酸乙酯含量达到0.74 g/L,比P. anomala单菌种发酵时提高了80%;发酵液风味物质的测定结果表明,S. cerevisiae与P. anomala的混合发酵能够形成更多的酯类物质,总酸和高级醇含量却相对较低,有效改善了发酵液的风味特性。4)将R. oryzae孢子悬浮液按10~5个/mL接种高粱培养基,30℃培养1 d后。接入10~7 CFU/mL的S. cerceisiae和P. anomala混合培养的种子液,进行固态混菌发酵,以酶液糖化的酵母混菌固态发酵作为对照组。整个发酵过程中,R. oryzae与酵母共同发酵时,乙醇浓度和乙酸乙酯含量都比对照组高;发酵结束时,乙醇浓度比对照组提高了13倍,乙酸乙酯含量增加了约1倍;风味物质的测定结果表明,与土曲发酵相比,R. oryzae、酵母的组合固态发酵蒸馏液中醇类物质降低了53%,总酸含量提高了35%,总酯含量提高了近1倍。