论文部分内容阅读
随着基因编辑技术的发展,规律间隔成簇短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeatsequences,CRISPR）结合Cas9蛋白系统已经在拟南芥、水稻和玉米等二倍体作物中得到了广泛应用。由于小麦是异源六倍体作物,基因组结构比较复杂,农杆菌介导CRISPR/SpCas9系统对小麦内源基因进行编辑的效率一直不高,特别是最新研发的CRISPR/LbCpf1和CRISPR/xCas9系统,在小麦中还未见相关报道,本研究拟利用之前研究中获得的无筛选标记材料H29,建立高效的小麦基因编辑系统,进而对小麦内源基因TaMTL、TaQ、TaWaxy和TaARG进行编辑,并对突变体进行表型鉴定和功能分析。主要研究结果如下:1.利用OsU6a、TaU3和TaU6启动子构建调控sgRNA表达的CRISPR/SpCas9载体,农杆菌介导对无筛选标记材料H29中的外源GUS基因进行编辑,发现TaU3调控sgRNA时的编辑效率最高（61.4%）。然后利用TaU3作为sgRNA的启动子,构建包含2个串联靶向外源GUS基因靶序列的编辑载体,发现GUS基因的编辑效率可达70.1%,2个靶点间的DNA片段删除效率为37.2%。进一步利用TaU3启动子和双靶点策略,构建靶向外源GUS基因的CRISPR/LbCpf1和CRISPR/xCas9编辑载体,发现CRISPR/LbCpf1和CRISPR/xCas9系统对外源GUS基因的编辑效率分别为3.1%和1.5%。2.构建2个串联靶点gM179和gM471,利用优化的CRISPR/SpCas9系统对小麦品种Fielder和宁春4号中单倍体诱导基因TaMTL进行编辑,编辑效率分别为57.5%和55.2%。在以宁春4号为受体的编辑植株中,发现TaMTL4A和TaMTL4B基因在2个靶点间的DNA片段删除效率分别为10.4%和8.9%;在以Fielder为受体的编辑植株中,发现TaMTL4A、TaMTL4B和TaMTL4D基因在2个靶点间的DNA片段删除效率分别为8.9%、5.9%和7.9%,并发现TaMTL4A和TaMTL4D基因在2个靶点间还出现了DNA片段删除后又反向插入的编辑类型。通过对TaMTL基因编辑植株进行表型、分子和细胞学鉴定,发现编辑植株的繁茂性和结实率等性状显著降低,单倍体诱导率平均为18.9%,同时,还发现了无胚型及胚和胚乳双无型变异的小麦籽粒。3.利用优化的CRISPR/SpCas9系统,对小麦品种Fielder和济麦22中位于5A和5D染色体上的TaAQ和TaDq基因进行编辑,发现Fielder和济麦22中TaQ基因的编辑效率分别为45.6%和44.0%;T0代突变体植株中TaQ基因发生突变使穗部形态发生了很大程度的改变,部分编辑植株不同分蘖表现出不同的穗型。进一步对T1代中TaAQ基因、TaDq基因单独发生编辑和同时发生编辑的突变体进行分析,发现TaDq基因编辑植株与对照相比除了株高降低外,其它性状无明显改变;TaAQ基因编辑和TaAQ、TaDq基因同时编辑的植株与对照相比差异较大,不仅穗部形态类似于拟斯贝尔脱小麦,而且还出现穗变长、小穗数减少、每小穗籽粒数减少和结实率降低等表型。4.利用优化的CRISPR/SpCas9系统和串联双靶点策略,对小麦品种宁春4号、Fielder、济麦22和中麦895中控制籽粒直链淀粉酶合成的TaWaxy基因进行编辑,4个品种的编辑效率分别为80.5%、71.6%、74.7%和66.7%。在编辑植株中,TaWaxy4A、TaWaxy7A和TaWaxy7D基因在2个靶点间检测到DNA片段删除的类型,并且还在TaWaxy4A和TaWaxy7A基因的2个靶点间检测到DNA片段删除后又反向插入的突变类型;利用I2-KI对TaWaxy基因发生编辑植株的籽粒进行染色,发现突变体籽粒的胚乳中基本不含直链淀粉;透射电镜结果显示,突变体籽粒的A型淀粉颗粒在形状和大小上都发生了改变。5.构建TaU6作为sgRNA启动子的表达载体,利用CRISPR/SpCas9系统对小麦品种Fielder中第二同源群上的TaARG基因进行编辑。检测结果表明,3个等位基因TaARG2A、TaARG2B和TaARG2D的编辑效率均不到10.0%。进一步对TaARG基因发生编辑的纯合突变植株进行分析,虽然突变植株的表型性状与对照相比无明显的差异,但是在转录水平上TaOAT、TaP5CDH和TaOTC基因在突变体的穗梗和种子中的表达量却显著降低,另外,在突变体的籽粒中,尸胺的含量与对照相比呈现一定的下降趋势,而亚精胺和精胺的含量与对照相比却呈现上升的趋势,并且在突变体的茎秆中除了赖氨酸外其余氨基酸和粗蛋白的含量都呈下降的趋势。