目的:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)占原发性肝癌(Primary liver cancer,PLC)的90%以上,是世界上肿瘤死亡的主要原因之一,我国原发性肝癌的发病率、死亡率均占全世界的50%以上,提高肝癌的早期诊断率和进一步开发治疗肝癌的有效药物,对于改善肝癌患者的预后和生活质量是非常有必要;miRNA异常表达于各种恶性肿瘤中,与肿瘤的发生、发展密切相关;当前研究显示miR-429在不同肿瘤中的表达水平和作用有明显差异,提示miR-429作为一个原癌或抑癌miR,与多种肿瘤的发生、发展有关,对肿瘤的诊断、治疗和预后有潜在临床应用价值;本实验通过检测肝癌中miR-429的表达情况,研究了其对肝癌增殖、迁移的影响,分析其靶基因TRAF6的表达及对肝癌增殖、迁移的影响,通过体内外实验进一步探究其在调节肝癌发生、发展中的关系。方法:1、临床标本和肝癌细胞系中采用Real time PCR检测miR-429的表达情况;2、在体外实验中,使用miR-429慢病毒和对照组空白慢病毒miR-CON分别转染肝癌细胞系SK-HEP1,然后采用MTT检测miR-429对肝癌细胞系增殖能力的影响;利用wound healing和Transwell实验检验miR-429对肝癌细胞系迁移能力的影响;3、运用生物信息学、荧光素酶报告实验检测miR-429的靶基因;4、采用质粒转染、回复实验检测mi R-429与TRAF6的相互调控关系,采用免疫荧光、Western blot检测miR-429在调控肝癌细胞增殖中的核心信号通路;5、采用裸鼠荷瘤体内实验检测miR-429对肝癌细胞增殖的影响。结果:1、通过Real time PCR检测发现,miR-429在肝癌组织中的表达水平明显降低,在癌旁组织中miR-429的表达水平较肝癌组织增加1.47倍;通过Real time PCR检测发现,与正常肝细胞HL7702对比,肝癌细胞中mi R-429的表达明显下调,其中SK-HEP1的表达下调最为明显。2、与转染空白对照组miR-CON相比,miR-429抑制肝细胞系増殖和生长能力(MTT法),提示miR-429可以影响肝癌的增殖能力。为检测miR-429是否会影响肝癌细胞迁移能力,我们进行了wound healing和Transwell实验,与对照组相比,SK-HEP1转染miR-429后愈合率下降到原来的65.52%;Transwell实验结果类似,与对照组相比,SK-HEP1转染miR-429后迁移能力下降到原来的45.67%。以上的结果显示,miR-429在肝癌细胞系中对肿瘤细胞的增殖、迁移能力具有明显的抑制作用。3、采用荧光素酶报告基因检测肝癌中traf6是mir-429的靶基因。与突变型载体traf6-3’utr-mut相比,traf6-3’utr-wt转染细胞的荧光信号值仅为对照的0.52;与空白载体相比,转染traf6-3’utr-wt野生型的细胞中的荧光信号值没有发生变化。以上结果显示,mir-429通过与野生型载体中的结合位点相结合,诱导了载体的降解并降低了荧光信号的释放。我们进一步通过westernblot检测了mir-429对traf6蛋白表达的影响:与转染空白载体的肝癌细胞相比,转染mir-429的细胞traf6蛋白的表达明显降低。因此,在肝癌细胞中表达増加的mir-429可以有效降低traf6蛋白质表达水平。traf6在肝癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织中的表达,mir-429在肝癌组织中的表达明显下调,提示mir-429在肝癌中可能作为抑癌因子存在,mir-429对肝癌肿瘤细胞増殖和侵袭的抑制作用可被traf6的髙表达逆转,traf6是mir-429的靶基因。4、在经过免疫组织化学检测后发现,traf6蛋白质在肝癌中呈明显的过度表达(p<0.01)。traf6主要是细胞质着色为主,仅有散在的细胞核着色,其中强表达病例数高这80%(20/25)。为检测traf6蛋白的表达増加是否可以逆转mir-429的肿瘤抑制作用,我们首先使用sitraf6转染了hcclm3细胞系,与对照组相比较,sitraf6组的细胞增殖能力、迁移能力受到了明显的抑制;但是当该组细胞转染了anti-mir-429后,其对肝癌细胞的增殖和迁移能力得到了明显的抑制,与对照组相比,无统计学差异。在体外细胞系中,我们将hcc细胞感染了lv-mir-429,然后采用免疫荧光检测p65的表达,结果显示p65明显的分布于细胞质,而经pcdna-traf6转染后,p65再次聚集于细胞核内。该结果表明mir-429在调控nf-kb信号通路中起着重要的作用。mir-429转染hcc细胞后会导致ptak1,cmyc和traf6表达的降低,而将该组重新转染pcdna-traf6后,发现ptak1,cmyc和traf6表达恢复到与对照组一致,该结果说明traf6表达的增加可抵消mir-429对hcc细胞系nf-kb信号通路分子的影响。综合以上结果表明:mir-429通过调控traf6的表达经由nf-kb信号通路发挥其生物学效应。5、我们也在体内环境下利用裸鼠模型检测了mir-429对肝癌肿瘤生长的作用。结果显示与对照mir-con转染细胞的皮下种植瘤模型相比,mir-429转染的皮下种植瘤的生长明显受到了抑制。在注射肿瘤细胞24天后,转染mir-429的肿瘤平均体积为对照组肿瘤体积的53.39%。通过免疫组化检测发现traf6和p65的表达明显降低。因此,mir-429转染肝癌细胞后可在体内和体外实验中显著降低肿瘤细胞的生长和增殖能力。结论:TRAF6是miR-429的一个新靶点,miR-429能够负向调节TRAF6及NF-kB通路,并且能够抑制肝癌细胞生长、增殖和转移。因此,深入研究miR-429在肿瘤中的功能及其作用机制,激活miR-429或抑制TRAF6的表达可能会成为肿瘤治疗中又一有效的治疗策略。