血浆/血清蛋白质由于其组成中包含了来源于细胞、组织、器官的蛋白信息,具有非同寻常的生物学复杂性,而且又是临床常见的用于疾病诊断与治疗的重要生物样本,因此对血浆蛋白组成的深入研究具有极其重要的生物学及医学价值,也正如此,国际人类蛋白质组组织首先启动了人血浆蛋白质组国际合作研究项目。 我们在参与并进行HUPO PPP项目初期研究中,先后对Bio-rad Aurum亲合柱,Agilent MARS亲合柱,制备溶液等电聚焦法Rotofor和有机溶剂沉淀法进行了考查,比较了各种方法的应用特点及局限性;在此基础上,我们选择了重复性好、去除高丰度蛋白选择性较强的Agilent MARS亲合柱用于HUPO PPP项目参考血浆和血清样品的处理方法,为完成HUPO PPP标准血浆/血清样品的分析鉴定及比较多种蛋白质组研究技术策略在血清蛋白质组研究中的应用准备了条件。 在已选定的利用亲合色谱法去除血浆六中高丰度蛋白基础上,选择高通量二维毛细管液相色谱离子阱串联质谱联用技术作为鉴定分析HUPO PPP标准血浆和血清样品的技术策略。在不断优化蛋白酶切方法及改进质谱数据扫描采集方法的基础上,改善了HUPO PPP提供的标准血浆和血清样品的蛋白鉴定结果,保证了分析结果重复性,完成了HUPO血浆蛋白质组研究项目中血浆及血清样品的分析工作:每个样品平均鉴定110余种蛋白质,蛋白鉴定水平处于所有参与实验室中等水平。 2003年在蒙特利尔召开的HUPO PPP项目阶段讨论会上,不同实验室之间提交的血浆/血清蛋白鉴定结果的重叠率很低。我们分析不同实验室蛋白鉴定结果间的低重叠率可部分归咎于所采取的不同样品处理方法以及不同的蛋白分离鉴定技术策略。为了系统比较不同样品制备方法和所采用的不同分离鉴定技术策略对血清蛋白鉴定结果的影响,我们采取了五种不同或相似的蛋白鉴定策略,对经过同一亲合色谱方法去除六种高丰度蛋白的HUPP PPP标准血清样品—中国人血清样品进行了系统分析。所比较的技术策略包括:2DE策略;整体蛋白预分离策略;在线“鸟枪法”蛋白鉴定策略;离线“鸟枪法”蛋白鉴定策略和离线“鸟枪法”纳升级电喷雾鉴定策略;通过比较五个不同技术策略蛋白鉴定结果来比较它们各自的应用特点、优点及局限性。每条技术路线鉴定的非冗余蛋白数分别是78,179,131,224和330。在全部560个血清蛋白的鉴定结果中,被五种技术共同鉴定的蛋白仅有37个,反映了不同技术策略蛋白鉴定结果具有明显的互补性。蛋白鉴定结果存在明显差异的原因主要是样品制备过程,肽混合物色谱分离效率及质谱检测灵敏度等存在明显差异。 在实际应用中,每个技术策略都有其各自的优点及局限性。2DE策略能提供更多的有关血清蛋白异构体的信息及蛋白的相对定量结果。蛋白二维色谱预分离