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禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC)是引发禽大肠杆菌病的重要病原菌,能引起禽类的局部或全身感染,严重危害养禽业的发展,因其与感染人的尿道致病性大肠杆菌(UPEC)、新生儿脑膜炎大肠杆菌(NMEC)等都具有高度基因同源性,被认为是可污染食品的致病性大肠杆菌重要的基因储库,具有潜在的公共卫生学风险。铁吸收调节蛋白(ferric uptake regulator,Fur)作为调节细菌中铁离子代谢的重要的蛋白质,是由Fur基因所编码的,是目前研究最为广泛和深入的与铁代谢的相关蛋白质;Ryh B是一种大小为90个核苷酸的细菌非编码小RNA分子(s RNA),受到负调控因子Fur的调节,目前有报道:Ryh B作为目前研究中己知的调控细菌靶m RNA数目最多的s RNA,与细菌包括APEC的致病性有一定的关系,因此阐明Fur/Ryh B在调控细菌生物表型及致病性方面是否具有协同作用并筛选下游调控靶点,对于揭示APEC的致病机理有一定的参考价值。本研究以Fur、Ryh B以及Fur/Ryh B整体作为研究对象,通过构建单、双基因缺失株来探究Fur、Ryh B以及Fur/Ryh B对APEC生物表型、关键毒力基因转录水平的影响;通过转录组学技术分析三株菌的差异基因富集情况,筛选差异显著的毒力基因进行EMSA验证。具体结果如下:1.禽致病性大肠杆菌Fur/Ryh B的单、双基因缺失株的构建及生物特性比较本试验通过Red同源重组技术成功构建了Fur单缺株与Fur/Ryh B双缺株(Ryh B单缺株为实验室保存)。比较三株菌的生物特性,结果显示Fur和Ryh B的缺失并不影响APEC的生长性能;△Fur和△Fur/Ryh B显著减弱APEC的运动能力以及鞭毛的数量和长度,△Ryh B对该表型影响不显著;△Fur和△Fur/Ryh B显著增强APEC生物被膜形成能力,△Ryh B稍减弱APEC生物被膜形成能力;△Fur和△Ryh B对细菌的常用抗生素耐药性影响不显著,△Fur/Ryh B能显著增加APEC对复方新诺明的敏感程度;△Fur和△Fur/Ryh B显著减弱APEC的氧化应激耐受能力,△Ryh B对其影响不显著。2.禽致病性大肠杆菌Fur/Ryh B的单、双基因缺失株的差异表达基因分析将Fur、Ryh B单缺株与Fur/Ryh B双缺株进行转录学组学分析,结果显示:Fur基因缺失的前后,APEC有1286个差异表达基因,其中649个基因上调,637个基因下调;Ryh B基因缺失的前后,APEC有1001个差异表达基因,其中459个基因上调,542个基因下调;Fur/Ryh B双基因缺失的前后,APEC有1266个差异表达基因,其中668个基因上调,598个基因下调。对这些差异表达基因进行GO分析及功能分类,结果显示:△Fur影响的差异表达基因主要富集在氧化还原过程、氧化还原酶活性和辅因子结合,但差异显著的基因富集在纤毛或鞭毛依赖性细胞运动等与趋化性相关的基因上。△Ryh B影响的差异表达基因主要富集在有机物生物合成过程、细胞生物合成过程、生物合成过程。△Fur/Ryh B影响的差异表达基因主要富集在氧化还原过程,同样的,与细胞运动性相关的基因差异倍数最大。在差异最大的鞭毛相关通路中有94%的基因(34/36)表达发生了下调,下调倍数最大的为Fli C,下调了约12倍;上述结果与荧光定量PCR验证结果基本一致。3.鉴定禽致病性大肠杆菌Fur调控鞭毛组成的下游靶点成功构建BL21-pet28a-Fur重组载体并表达,Fur蛋白在16℃上清表达效果最佳并具有蛋白活性,测量目的蛋白浓度为0.3μg/μL。筛选鞭毛调控关键基因Flh D以及Fli A,合成生物素探针进行EMSA试验检测Fur蛋白与Flh D、Fli A基因相互作用情况。结果显示Fur蛋白不与Fli A的标记探针发生结合,能和Flh D的标记探针结合但没有观察到浓度依懒性,这说明Fur可能直接调控FlhD,从而下调鞭毛相关基因。