食管癌是人类最常见的消化系统恶性肿瘤之一,其发病率在全世界恶性肿瘤发病率中排名第八位。食管癌在我国也具有较高的发病率。依据食管癌病理类型的不同,可将其分为食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)。其中,我国约有 90%的食管癌患者为ESCC。由于食管癌早期发病症状不明显,并且缺乏有关食管癌的早期筛查方法,多数患者在就诊时就已经处于中晚期,患者治疗疗效和预后较差。目前,食管癌的发病机制尚不十分明确,因此,深入研究食管癌发病机制并寻找早期诊断的分子生物标记物和临床治疗的潜在作用靶点,对提高食管癌患者生存质量和改善预后具有十分重要的意义。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)是一类长度大于200个核苷酸但不编码蛋白质的RNA,可在转录、转录后、表观异常等多个水平调控基因表达。随着研究的深入,发现LncRNA在多种肿瘤中异常表达,这些异常表达的LncRNA可影响肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为,与肿瘤的发生发展关系密切,可用作肿瘤诊断的分子标志物以及判断患者预后。研究显示,LncRNA SNHG1在结肠癌、肺癌和前列腺癌等多种肿瘤中高表达,参与肿瘤发生发展过程。但是,SNHG1是否调控ESCC的发展过程及作用机制的相关研究还很少见。微小RNA(micro RNA,miRNA)是一类长度为18～25个核苷酸的单链小分子RNA,其可与特定的mRNA结合或者调节特定mRNA的蛋白质翻译过程来调控基因的表达,广泛的参与各种生理和病理过程。miR-204定位与人9号染色体,在乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、食管癌等多种肿瘤中异常表达,参与肿瘤的发生和发展。近年来研究表明,LncRNA和miRNA之间还存在密切的相互作用,两者共同参与疾病的发生和发展。通过生物信息网站预测发现,SNHG1与miR-204基因序列存在结合位点,miR-204可能是SNHG1的靶基因。SNHG1能否调控miR-204表达影响ESCC细胞的生物学行为也还未知。生物信息学软件预测还显示,同源异型盒基因8(HOXC8)是miR-204的靶基因。研究显示,HOXC8参与非小细胞肺癌、等肿瘤细胞的增殖、生长和迁移,与肿瘤发生发展密切相关。有报道称,HOXC8高表达的ESCC患者中位生存时间显著低于HOXC8低表达患者,HOXC8表达是ESCC患者预后的独立影响因素,可用作ESCC的预后标志物。但是,HOXC8在ESCC组织和细胞中表达水平及其对ESCC细胞生物学行为的影响也还未知。因此,为了明确SNHG1在ESCC中的作用及可能的作用分子机制,本研究进行了以下三部分研究:第一部分:首先检测了 SNHG1在ESCC组织中的表达,分析了其表达与患者临床病理特征的关系;检测ESCC细胞系EC9706、KYSE450、KYSE150和Eca109中SNHG1的表达水平,并观察下调SNHG1表达对EC9706和KYSE150细胞周期、凋亡、增殖、迁移和侵袭的影响;第二部分:以miR-204/HOXC8轴为切入点,探究SNHG1影响EC9706和KYSE150细胞周期、凋亡、增殖、迁移和侵袭的分子机制;第三部分:通过建立食管鳞癌移植瘤裸鼠模型,探讨了 SNHG1对食管鳞癌移植瘤裸鼠肿瘤生长的影响。第一部分SNHG1在ESCC中的表达及其对细胞生物学行为的影响背景:LncRNA是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA,其在恶性肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用,参与肿瘤细胞的恶性生物学行为。研究显示,肿瘤中异常表达的lncRNA与患者临床病理特征以及预后密切相关,可作为肿瘤诊断、预后判断的分子生物学标记物。研究显示,SNHG1在结直肠癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤中表达异常,参与肿瘤的发生和发展过程,是肿瘤诊治的潜在生物学标志物。目前,SNHG1在食管鳞状细胞癌中表达的研究相对较少。目的:探索LncRNA SNHG1在食管鳞癌组织及细胞中的表达情况及对食管鳞癌细胞的生物学行为的影响。方法:收集53例ESCC患者的癌组织及对应癌旁组织标本,qRT-PCR法检测SNHG1在ESCC癌组织和癌旁组织中的表达水平。根据ESCC患者癌组织中SNHG1表达水平的均值,将ESCC患者分为SNHG1高表达组和低表达组,卡方检验分析SNHG1表达与ESCC患者年龄、性别、TNM分期、肿瘤位置及预后的相关性。比较不同年龄、性别、TNM分期和肿瘤位置ESCC患者癌组织中SNHG1表达水平。体外培养正常食管上皮细胞Het-1A和ESCC细胞系EC9706、KYSE450、KYSE150、Eca109中SNHG1表达水平,qRT-PCR检测细胞中SNHG1表达水平。EC9706和KYSE150细胞分为空白组、si-NC组和si-SNHG1组,si-NC组和si-SNHG1组分别转染si-NC、si-SNHG1,空白组不做任何处理。应用qRT-PCR法检测转染后细胞中SNHG1表达水平,流式细胞术检测转染后EC9706和KYSE150细胞周期变化和细胞凋亡率,CCK-8法检测细胞增殖,Transwell检测细胞迁移和侵袭。结果:(1)qRT-PCR结果显示,ESCC组织中SNHG1表达水平显著高于对应癌旁组织(P<0.05)。(2)SNHG1表达与ESCC患者TNM分期及预后关系密切(P<0.05),与ESCC患者年龄、性别和肿瘤位置无关(P>0.05)。(3)ESCC患者TNM分期越高,癌组织中SNHG1表达水平越高。而不同年龄、性别和肿瘤位置的ESCC患者癌组织中SNHG1表达水平比较无统计学意义(P>0.05)。(4)与 Het-1A 细胞比,ESCC 细胞系 EC9706、KYSE450、KYSE150、Eca109中SNHG1表达水平均显著升高(P<0.05)。并且ESCC细胞系之间比较,EC9706和KYSE150细胞中SNHG1表达水平相对较高,因此,选择EC9706和KYSE150细胞作为后续实验研究对象。(5)与 si-NC 组相比,si-SNHG1组EC9706 和 KYSE150 细胞中 SNHG1 表达水平显著降低(P<0.01),G0-G1期细胞百分比显著升高(P<0.01),S期显著降低(P<0.01),细胞凋亡率显著升高(P<0.001),细胞0D值显著降低(P<0.001),细胞迁移和侵袭数量显著减少(P<0.01)。空白组与si-NC组各检测指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:SNHG1在ESCC患者癌组织中呈高表达,其高表达与患者TNM分期及预后关系密切。SNHG1在ESCC细胞系中呈高表达,下调SNHG1表达可阻滞EC9706和KYSE150细胞周期进程,促进细胞凋亡,并抑制细胞增殖、迁移和侵袭。第二部分SNHG1对ESCC细胞生物学特性影响的机制研究背景:LncRNA和miRNA均作为重要的基因表达调控分子在肿瘤的发生和发展中扮演重要角色,它们之间还存在密切的相互作用,两者之间的相互作用参与了众多疾病的发生和发展。研究发现,LncRNA可作用于miRNA影响肿瘤的发生和发展过程。通过生物信息网站预测发现,SNHG1与miR-204基因序列存在结合位点,miR-204可能是SNHG1的靶基因。生物信息学软件预测还显示,同源异型盒基因8(HOXC8)是miR-204的靶基因。同源异型盒基因(HOX基因)起初是在研究果蝇胚胎发育的过程中发现的,目前,已被鉴定出的HOX基因有39个。HOX基因家族成员均编码其对应的转录因子,在一系列基因的表达过程中发挥调控作用。HOX基因编码的蛋白质形成一个转录因子调控网络。在机体正常的生命活动中,参与细胞的通讯过程,当HOX基因编码的蛋白质发生改变后可导致肿瘤的产生。HOXC8在ESCC组织和细胞中表达水平及其对ESCC细胞生物学行为的影响以及miR-204能否通过调控HOXC8表达影响ESCC细胞的生物学行为还未知。目的:以miR-204/HOXC8轴为切入点,探讨SNHG1对ESCC细胞系EC9706和KYSE150细胞周期、凋亡、迁移和侵袭的影响的分子机制。方法:qRT-PCR法检测ESCC组织和癌旁组织中miR-204和HOXC8 mRNA表达水平。体外培养正常食管上皮细胞Het-1A和ESCC细胞系EC9706、KYSE450、KYSE150、Eca109中SNHG1表达水平,qRT-PCR法检测细胞中miR-204和HOXC8 mRNA表达水平。Starbase生物信息学软件预测SNHG1与miR-204序列存在结合位点,HOXC8的3’UTR与miR-204序列存在结合位点。双荧光素酶报告基因和RNA免疫共沉淀(RIP)实验验证EC9706和KYSE150细胞中SNHG1与miR-204及miR-204与HOXC8的靶向调控关系。EC9706和KYSE150细胞分为pcDNA组(转染空载体)、SNHG1组(转染SNHG1过表达载体)、si-NC组(转染乱序无意义阴性序列)和si-SNHG1组(转染SNHG1小干扰RNA),qRT-PCR法检测上调或下调SNHG1对细胞中miR-204表达水平的影响。EC9706 和 KYSE150 细胞分为 miR-204 组(转染 miR-204 模拟物 mimics)、miR-NC 组(转染 mimics 对照序列)、si-SNHG1+anti-miR-204 组(共转染 SNHG1小干扰 RNA 和 miR-204 抑制剂)和 si-SNHG1+anti-miR-NC 组(共转染 SNHG1小干扰RNA和抑制剂阴性对照序列),流式细胞术检测各组EC9706和KYSE150细胞周期变化和细胞凋亡率,CCK-8检测各组细胞增殖,Transwell检测各组细胞迁移和侵袭。EC9706 和 KYSE150 细胞分为 miR-204 组(转染 miR-204 模拟物 mimics)、miR-NC组(转染mimics对照序列)、anti-miR-204组(转染miR-204抑制剂)和ani-miR-NC组(转染抑制剂阴性对照序列),Western Blot检测上调或下调miR-204对细胞中HOXC8蛋白表达的影响。EC9706 和 KYSE150 细胞分为将 miR-204+pcDNA 组(共转染 miR-204 mimics 与空载体)和 miR-204+HOXC8 组(共转染 miR-204 mimics 与 HOXC8过载体载体),Western Blot检测各组细胞中HOXC8蛋白表达水平,流式细胞术检测各组细胞周期变化和细胞凋亡率,CCK-8检测各组细胞增殖,Transwell检测各组细胞迁移和侵袭。结果:(1)与 Het-1A 细胞比,ESCC 细胞系 EC9706、KYSE450、KYSE150、Eca109中miR-204表达水平均显著降低(P<0.05),HOXC8 mRNA表达水平均显著升高(P<0.05)。与癌旁组织相比,ESCC癌组织miR-204表达水平均显著降低(P<0.05),HOXC8 mRNA表达水平均显著升高(P<0.05)。(2)双荧光素酶报告基因结果显示,与质粒SNHG1-WT共转染,miR-204组的荧光素酶活性显著低于miR-NC组(P<0.001);与质粒SNHG1-MUT共转染,miR-204组的荧光素酶活性与miR-NC组比较无统计学意义(P>0.05)。RNA免疫共沉淀(RIP)实验结果显示,与miR-NC组相比,miR-204组捕获的SNHG1量显著升高(P<0.001)。(3)与pcDNA组相比,SNHG1组EC9706和KYSE15细胞中miR-204表达水平显著降低(P<0.001);与si-NC组相比,si-SNHG1组EC9706和KYSE150细胞中miR-204表达水平显著升高(P<0.001)。(4)与 miR-NC 组相比,miR-204 组 EC9706 和 KYSE150 细胞中 miR-204 表达水平显著升高(P<0.01),G0-G1期细胞百分比显著升高(P><0.01),S期显著降低(P<0.01),细胞凋亡率显著升高(P<0.001),OD值显著降低(P<0.001),细胞迁移和侵袭数量显著减少(P<0.01)。与si-SNHG1+anti-miR-NC组相比,si-SNHG1+anti-miR-204 组 EC9706 和 KYSE150 细胞中 miR-204 表达水平显著降低(P<0.01),G0-G1期细胞百分比显著降低(P<0.01),S期显著升高(P<0.01),细胞凋亡率显著降低(P<0.001),OD值显著升高(P<0.001)细胞迁移和侵袭数量显著增多(P<0.01)。(5)双荧光素酶报告基因结果显示,与质粒HOXC8-WT共转染,miR-204组的荧光素酶活性显著低于miR-NC组(P<0.001);与质粒HOXC8-MUT共转染,miR-204组的荧光素酶活性与miR-NC组比较无统计学意义(P>0.05)。RNA免疫共沉淀(RIP)实验结果显示,与miR-NC组相比,miR-204组捕获的HOXC8表达量显著升高(P<0.001)。(6)与 miR-NC 组相比,miR-204 组 EC9706 和 KYSE15 细胞中 HOXC8 蛋白表达水平显著降低(P<0.001);与 anti-miR-NC 组相比,anti-miR-204 组EC9706和KYSE150细胞中HOXC8蛋白表达水平显著升高(P<0.001)。(7)与 miR-204+pcDNA 组相比,miR-204+HOXC8 组 EC9706 和 KYSE150 细胞中HOXC8蛋白表达水平显著升高(P<0.01),G0-G1期细胞百分比显著降低(P<0.01),S期显著升高(P<0.01),细胞凋亡率显著降低(P<0.001),OD值显著升高(P<0.001)细胞迁移和侵袭数量显著增多(P<0.01)。结论:miR-204在ESCC组织和细胞系中均呈低表达,HOXC8 mRNA呈高表达。EC9706和KYSE15细胞中SNHG1靶向负调控miR-204表达,miR-204靶向负调控HOXC8表达。下调SNHG1通过靶向miR-204下调HOXC8蛋白表达,阻滞ESCC细胞周期进程,促进细胞凋亡,并抑制细胞增殖、迁移和侵袭。第三部分SNHG1对食管鳞状细胞癌裸鼠体内移植瘤影响背景:食管鳞状细胞癌的发生发展多是由于基因的异常表达引起的。随着人类基因技术的快速进步,通过对基因分子水平的改变及不同基因间的相互关系的研究,探讨某种基因变化与肿瘤发生和发展之间的关系,直接通过调控异常表达的基因可达到治疗肿瘤的目的。短发夹状干扰RNA(shRNA)技术是一种新兴的基因治疗技术,其在基因分子水平沉默异常表达的癌基因,进而实现能够有效且特异性抑制肿瘤生长的作用。自shRNA技术被发现以来,已经在肿瘤基因治疗研究领域被广泛的应用。目的:通过构建重组慢病毒表达载体sh-SNHG1,进一步进行裸鼠体内研究实验,旨在说明SNHG1被干扰抑制后对食管鳞状细胞癌裸鼠皮下移植瘤的生长有无影响。方法:建立食管鳞状细胞癌裸鼠皮下移植瘤模型。裸鼠分为Empty组:接种EC9706细胞;sh-NC组:接种转染sh-NC的EC9706细胞;sh-SNHG1组:接种转染sh-SNHG1 的 EC9706 细胞。观察裸鼠皮下移植瘤生长,每周测量移植瘤长、短径计算瘤体体积,并绘制移植瘤生长曲线。5周后脱颈椎处死小鼠,剥离肿瘤并称重。qRT-PCR检测移植瘤组织中SNHG1和miR-204表达,Western blot法和免疫组化法检测移植瘤组织中HOXC8蛋白表达。结果:(1)与Empty组、sh-NC组相比,sh-SNHG1组裸鼠皮下移植瘤生长缓慢,瘤体体积和重量显著减小(P<0.05)。(2)与Empty组、sh-NC组相比,sh-SNHG1组裸鼠皮下移植瘤组织中SNHG1表达水平显著降低(P<0.05),miR-204表达显著升高(P<0.05),HOXC8蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论:沉默SNHG1通过上调miR-204表达进而抑制HOXC8蛋白表达,抑制食管鳞状细胞癌裸鼠皮下移植瘤的生长。全文结论:(1)LncRNA SNHG1在食管鳞癌组织以及食管鳞癌细胞系中高表达,属于促癌基因;(2)LncRNA SNHG1通过靶向miR-204表达,进而促进HOXC8蛋白表达,促进ESCC细胞的细胞周期进程、增殖、迁移和侵袭,并抑制细胞凋亡。