研究目的近年来Toll样受体家族（Toll-like Receptor,TLRs）在机体免疫应答中的意义受到高度关注。TLRs家族成员作为一种模式识别受体（pattern recognitionreceptor,PRR）可特异性识别病原相关分子模式（pathogen-associated molecularpatterns,PAMPs）,不仅在激活天然免疫中发挥重要作用,而且还在诱导和调节获得性免疫中具有重要意义,是连接天然免疫和获得性免疫的重要桥梁。TLRs信号可以在自身抗原,同种抗原和异种抗原的刺激下激活。2008年最新研究发现小鼠心脏皮肤同种移植物的长期生存需要天然Tregs的存在,TLR9的特异激活剂CpG可以通过抑制Treg的功能和促进Th1效应性T细胞的分化,抑制同种移植物的存活。TLR7的激活可以促进皮肤同种移植物的排斥;TLR4的激活阻断了利用抗CD154单抗建立的心脏同种移植物的长期存活,阻止了CD4⁺/Foxp³⁺Treg在移植物的聚集,因此TLRs信号的激活状态对移植物的耐受或排斥非常关键。研究显示,CD4⁺ CD25⁺调节性T细胞（Treg）参与多种途径诱导的移植免疫耐受,Treg不仅在维持自身耐受方面发挥重要作用,而且在防治同种移植物排斥方面也有重要意义。因此如何有效扩增Treg细胞是诱导移植耐受的关键因素之一。近来研究发现TLR5是唯一具有免疫负调节作用的分子,可直接间接地参与自身免疫病的发病过程。细菌鞭毛蛋白（Flagellin）是TLR5的唯一配体,Flagellin可特异识别结合TLR5,通过激活核转录因子NF-κB刺激TNF-α、IL-1β、IL-8等前炎症细胞因子的产生,介导机体天然免疫。以往研究表明Treg功能的调节主要是通过细胞因子或者是通过APCs细胞上共刺激分子来实现的,然而新的证据表明Treg可以通过TLRs直接感受外来抗原的刺激,TLR5选择性高表达在Treg细胞上,TLR5的特异激活剂Flagellin可增强Treg对效应性T细胞的抑制作用。2008年有研究报告体内给予TLR5特异激活剂Flagellin,可以保护机体免受化学、细菌病毒和辐射等损害。因此如何通过TLRs调控Treg细胞活性,对于诱导机体免疫耐受具有重要意义。免疫抑制药物雷帕霉素（Rapamycin,Rapa）和环孢素A（Cyclosporin A,CsA）广泛用于器官移植后的抗移植物排斥反应,并且在实验模型中作为诱导免疫耐受的工具。近来研究报道Rapa在体外可以选择性地扩增正常小鼠的天然CD4⁺CD25⁺调节性T细胞,而不阻断该小鼠CD4⁺T细胞的扩增和活化诱导细胞凋亡,但其确切机制尚不清楚,而CsA则可抑制TCR介导的T细胞激活和IL-2的产生。提示CsA和Rapa对Treg可能有不同的作用。我们前期的研究证实Rapa和CsA体内处理可以明显增加同种移植受体的Treg比例,增强Foxp3的表达。但是即使体内使用Rapa,同种移植个体中的Treg比例仍然处于较低水平。因此如何通过调节Treg细胞活性,体内扩增Treg细胞,更好地诱导同种移植耐受仍是目前亟待解决的问题。综上所述,迄今为止的研究表明Treg细胞具有免疫负调节作用,TLR5的激活对某些损伤因素具有免疫保护作用,Treg细胞上TLR5/TLR7/8高表达,但是同种移植状态下,TLR5的活化状态和活化的调节及对Treg的影响途径、机理和信号传导途径尚不清楚。我们推测利用Flagellin刺激同种移植TLR5活化,可能在体内扩增Treg的比例,增强Foxp3的表达,从而达到形成移植耐受的目的。本课题首先分析了同种皮肤移植急性排斥过程中TLR5和Foxp3基因的动态表达状况,然后应用Rapa和CsA两种不同的免疫抑制剂对小鼠同种皮肤移植模型进行耐受初步诱导,研究了Rapa和CsA体内应用对TLR5和Foxp3基因表达的影响及与移植物生存的关系:研究了Flagellin体外处理对移植耐受模型中T细胞及相关分子TLR5、Foxp3表达影响及与Rapa和CsA是否与协同作用;探讨了同种移植状态下TLR5表达的变化及意义,探讨TLR5和Foxp3表达的相关性,旨在阐明Rapa、CsA及Flagellin在同种移植耐受状态下,是否能够通过激活TLR5,增强Treg的活性,强化免疫耐受的诱导,为利用TLR5特异配体-Flagellin和抗排斥药物Rapa、CsA联合进行同种移植耐受诱导奠定实验基础,为CD4⁺CD25⁺Treg体外扩增和应用于临床防治同种移植排斥反应探索新的途径。实验方法1.Flagellin的提取和鉴定:利用LB营养培养基扩增甲型副伤寒杆菌,用PBS离心后洗涤按照文献[25]方法分离粗制鞭毛蛋白（Flagellin）,然后通过Sephacryl S-200凝胶柱分离不同分子量的蛋白质,通过SDS-PAGE观察并收集目的蛋白（Flagellin）,透析过夜,然后利用抗Flagellin抗体,通过Western Blot检测目的蛋白的特异性。纯化的Flagellin溶液经紫外分光光度仪测光密度00₂₆₀、OD₂₈₀值,按照公式计算蛋白含量,置—20℃储存。2.体内实验:以B6小鼠为供体,BABL/c小鼠为受体,建立小鼠同种皮肤移植模型。移植后第1天BABL/c小鼠分别给予Rapa（1.5mg/kg）或CsA（10mg/kg）及生理盐水腹腔注射进行耐受诱导,每日1次,连续14日。移植后第1、7、10、14、21天,分别取实验组及对照组小鼠脾脏及移植部位的皮片,采用异硫基氢酸胍（TRIzol）一步法提取细胞总RNA,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）对转录产物进行扩增,以GAPDH作为对照,检测TLR5及Foxp3mRNA的相对表达量。3.体外实验:分离纯化同种移植后第10天的小鼠脾T细胞,加入不同浓度的Flagellin处理3、6、12h后测定TLR5和Foxp3 mRNA的表达量,探讨Flagellin作用的最佳浓度及时间;进而在移植后第10天,提取耐受诱导的BABL/c小鼠脾细胞（术后第14天对照组移植皮片全部排斥）T细胞,经不同浓度Flagellin、Rapa、CsA体外处理后,RT-PCR检测TLR5及Foxp3 mRNA的相对表达量。同时选择未行移植术的正常BALB/c小鼠T细胞,经不同浓度Flagellin、Rapa、CsA体外处理后,检测TLR5及Foxp3 mRNA的相对表达量。实验结果1.SDS-PAGE显示在分子量为52kD处有目的蛋白条带,Western Blot结果显示抗鞭毛抗体染色呈阳性。表明鞭毛蛋白提取成功。提取的蛋白浓度为75.03μg/ml。2.与生理盐水对照组（12.8±1.6d）相比,同种移植后体内应用CsA（22.0±1.9d）或Rapa（23.8±2.1d）均可明显延长移植皮片的存活期（p＜0.05）。Rapa处理组与CsA处理组相比,延长移植物存活的能力无明显差别,但Rapa处理组小鼠生存状态比CsA处理组更佳。3.对照组同种移植后TLR5和Foxp3的表达均在排斥高峰期（移植后第10d）升高最明显,之后Foxp3的表达迅速下降,而TLR5的表达持续到移植后14d才开始下降。小鼠皮片急性移植排斥期1、7、10、14、21天,移植受体脾细胞的TLR5与Foxp3变化趋势明显正相关。4.体内给予CsA后,TLR5和Foxp3的表达第7天就明显升高,第10天达到高峰,Foxp3在第14天恢复至起始水平,而TLR5在第21天恢复至起始水平;与对照组相比,在同种皮片移植后1、7、10、14、21天,Rapa体内处理组脾细胞TLR5 mRNA表达明显上调;TLR5表达量较CsA组和对照组明显增多,且停药后,第21天表达量仍明显高于CsA组和对照组。而Foxp3的表达的变化与CsA组无显著变化。5.体外实验证明:1)Flagellin、Rapa、Flagellin+Rapa、Flagellin+CsA均可促进正常BABL/c小鼠T细胞的TLR5 mRNA明显高表达（p＜0.05）,其中Flagellin+Rapa联合处理组增高更明显,而单独用CsA处理组与未处理组相比无统计学差异。Flagellin处理组、Rapa组、Flagellin+Rapa联合处理组、Flagellin+CsA联合处理组的Foxp3 mRNA均明显高表达（p＜0.05）,其中Flagellin+Rapa联合处理组的变化最明显。单独使用CsA处理组与未处理组相比无统计学差异。2)经不同浓度Flagellin处理急性排斥期小鼠T细胞不同时间后发现,TLR5 mRNA在Flagellin浓度100ng/ml,培养6h表达最高。Foxp3mRNA在Flagellin浓度1000ng/ml,培养6h表达最高,且在所研究的各时间点,Flagellin均能促进Foxp3表达。3)Flagellin、Flagellin+Rapa、Flagellin+CsA均可促进急性排斥期BABL/c小鼠T细胞的TLR5 mRNA表达,其中Flagellin+Rapa联合组增高更明显,而单独用CsA或Rapa处理组的TLR5 mRNA表达无显著改变。Flagellin、CsA、Rapa、Flagellin+Rapa、Flagellin+CsA联合处理均可促进Foxp3 mRNA表达,其中Flagellin+Rapa联合处理组增高更明显。结论1.体内应用Rapa或CsA均可明显延长同种移植皮片的存活时间,Rapa在抑制移植物排斥、改善宿主生存状态方面效果明显优于CsA。2.同种移植急性排斥高峰期,TLR5和Foxp3表达升高,Rapa可以明显增强同种移植排斥期TLR5与Foxp3的表达,尤其是使Foxp3表达持续升高,CsA也可促进这两种基因的表达,但持续时间较短。3.成功提取甲型副伤寒杆菌的鞭毛蛋白并进行了初步鉴定。4.Rapa在体外可促进移植耐受模型T细胞的TLR5和Foxp3的基因表达,Flagellin可以协同增强Rapa这一作用。CsA可促进排斥高峰期T细胞Foxp3表达,但对TLR5表达无明显影响,与Flagellin无协同作用。Flagellin体外可以促进排斥高峰期T细胞TLR5和Foxp3的表达,并增强Rapa的作用效果。5.Rapa和Flagellin体外均可促进正常小鼠脾T细胞的TLR5和Foxp3的表达,且相互具有协同作用。CsA对正常小鼠T细胞的TLR5和Foxp3的表达无明显作用。