论文部分内容阅读
植物microRNAs(miRNAs)是一类长度为20-24 nt的非编码小RNA,通过抑制mRNA的翻译或者降解mRNA来调控靶基因的表达。miR408是由21个核苷酸组成的高度保守的miRNA分子,在多个物种中已有报道。研究表明,miR408在植物体内可参与非生物胁迫应答、维持铜离子平衡,miR408过表达的拟南芥幼苗其花青素含量是对照的7-8倍,说明miR408可能参与植物的次生代谢调控。丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge),唇形科多年生药用植物,其根是我国传统大宗药材,对心脑血管疾病、组织损伤、血脂升高等具有很好疗效,被誉为“药用模式植物”。目前关于丹参中miRNA的功能研究尚未见报道。本实验从丹参中克隆得到miR408前体序列,进一步获得该基因的过表达转基因烟草及干涉转基因丹参株系,以期对调控丹参次生代谢产物的生物学功能进行初步研究。本实验的研究内容与结果如下:1.基于丹参基因组Survey数据库,从中搜索并通过PCR克隆得到长度为366 bp的miR408前体序列及长度为723 bp的上游启动子区,并将miR408的前体序列命名为Sm-MIR408。通过生物信息学分析,发现miR408前体序列能够形成稳定的茎环结构,而且成熟的miR408序列碱基保守性很高,启动子区包含多种与光照、茉莉酸甲酯相关的顺时作用元件。实时定量PCR结果显示,Sm-MIR408在根、茎、叶、花中都有表达,且受到铜、光照、茉莉酸甲酯等因素的影响。2.采用传统双酶切的方法成功构建了Sm-MIR4 8启动子-GUS报告基因融合载体。通过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草,选择培养筛选得到Sm-MIR408-Promoter::GUS转基因株系,研究Sm-MIR408基因启动子区的活性,经DNA水平及GUS染色检测,获得11株阳性株系。根据启动子区顺式作用元件分析结果,对转基因烟草分别进行不同铜浓度、茉莉酸甲酯、伤害及光照处理,GUS染色结果表明,Sm-MIR408启动子区均受到以上因素的调控,如:与对照组(0.1 uM Cu2+)相比,在缺铜(0 uM Cu2+)的条件下,烟草幼苗GUS表达量提高,而在足铜(5uMCu2+)的条件下,烟草幼苗GUS表达量降低。3.成功构建Sm-MIR408过表达载体,采用农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草,得到Sm-MIR408过表达的转基因株系,经DNA水平检测获得9个阳性株系。实时定量PCR结果显示,与对照株系相比,过表达阳性株系均检测到Sm-MIR408和Sm-miR408的表达,说明Sm-MIR408基因已经整合到烟草的基因组中;检测烟草miR408靶标的表达,结果表明在烟草中异源表达Sm-MIR408后,靶基因Nb-Copper-transporting ATPase PAA2及Nb-Uclayanin-2的表达量都显著下调。4.利用artificial microRNAs(amiRNAs)介导基因沉默的原理,成功构建Sm-MIR408干涉载体,利用农杆菌介导的叶盘转化法转化丹参,在选择培养基上筛选转基因干涉株系,经DNA及RNA水平检测共获得5个阳性株系,选取Sm-MIR408表达量较低的amiR-408-3、amiR-408-4株系进行后续的实验。利用生物信息学对Sm-miR408的靶标进行预测,实时定量PCR结果显示,在干涉丹参amiR-408-3、amiR-408-4株系中Sm-LAC13的表达量显著高于对照,因此Sm-LAC13可能miR408的靶标。通过对干涉及对照株系进行总酚、总黄酮含量的检测,结果显示,干涉株系中总酚、总黄酮含量高于对照株系。利用HPLC对继代培养60 d的组培丹参活性成分含量进行测定,结果显示,干涉株系中迷迭香酸及丹酚酸B的含量相较于对照株系显著升高,其中迷迭香酸上升了约1.4～1.8倍,丹酚酸B上升了约2.5～4.1倍,而隐丹参酮及丹参酮ⅡA含量没有显著性差异。利用实时定量PCR对次生代谢途径上的关键酶基因进行检测,结果显示,酚酸类物质合成途径上酶基因TAT1、HPPR1、PAL2、C4H1、4CL2的表达均显著上调。综上所述,Sm-miR408在丹参次生代谢调控方面可能发挥着作用,为进一步探究miR408在丹参中的功能奠定一定的基础。