B淋巴细胞（B lymphocyte）的发育和分化是一个有序的选择过程,受内部基因程序和外部因素（例如胎肝和骨髓特殊微环境中存在的细胞因子）调控。B淋巴细胞起源于骨髓中的造血前体细胞,发育过程中伴随免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）的基因重排。祖B细胞（Pro-B cells）重新排列其Ig重链（HC）基因,以分化成表达μHCs的前B细胞（Pre-B cells）;前B细胞重新排列其Ig轻链（LC）基因,分化为表达IgM的未成熟B细胞（Immature B cells）,这一阶段属于抗原非依赖过程。未成熟B细胞经血液循环到达外周免疫器官,成为IgM+IgD+成熟静止B细胞（Mature B cells）;经抗原刺激后B细胞活化,进入生发中心,进一步分化成浆细胞或者记忆细胞,发挥免疫功能。长链非编码（long noncoding RNA,lncRNA）RNA是一类不编码蛋白、转录本长度普遍大于200个核苷酸的非编码RNA。根据lncRNA与附近蛋白编码基因的关系,可以分为基因内lncRNA、基因间lncRNA、正义lncRNA、反义lncRNA和双向lncRNA等。许多研究揭示,lncRNA可以在表观遗传水平、转录水平和转录后水平调节基因和蛋白质的表达。LncRNA参与许多生物学过程,例如细胞增殖、分化和凋亡,个体发育和疾病发展。另外,lncRNA也广泛参与免疫系统的发育。目前已经有文献报道lncRNA可以调控淋巴细胞的成熟,成为免疫调控机制研究的热点领域。据文献报道,在B细胞发育不同阶段存在表达差异的LncRNAs可能在B细胞发育、增殖、分化、活化以及抗体分泌等过程中发挥重要的生物学作用。课题组前期利用二代测序技术筛选了小鼠B淋巴细胞发育相关的lncRNAs,经过生物信息学分析（编码潜能、基因位置等）结合生物化学和分子生物学实验逆向验证结果确定了在B细胞发育过程中变化差异明显的lncRNA 139作为研究对象。利用RNAi技术成功设计了能够有效敲降lncRNA 139基因的干扰序列,制备了高滴度慢病毒和特异性敲低lncRNA 139的小鼠模型,探讨lncRNA 139低表达在B淋巴细胞发育中的作用。期望进一步揭示B淋巴细胞发育及成熟的机制,为临床中自身免疫疾病和B细胞相关肿瘤的治疗提供参考。目的探究lncRNA 139在B淋巴细胞发育及活化过程中的生物学功能与作用机制,为一些特异性表达的LncRNAs作为自身免疫疾病或B细胞相关肿瘤临床诊断的标志物和治疗靶点提供新的研究方向和理论依据。方法1、通过查找相关文献,初步确认高度可信的在B淋巴细胞发育不同阶段表达量存在差异的lncRNAs目录,进一步筛选出表达量差异较明显的lncRNA 139作为本课题的研究对象。2、利用RNA荧光原位杂交技术等明确lncRNA 139基本特征。3、设计并合成用于沉默lncRNA 139的siRNA,以PLKO.1为载体制备高滴度慢病毒,通过骨髓腔注射方法构建稳定低表达lncRNA 139的小鼠模型。4、探究lncRNA 139对小鼠体内B淋巴细胞发育过程的影响:流式细胞仪检测低表达lncRNA 139小鼠骨髓、外周血、脾脏各发育阶段B淋巴细胞比例。5、探究lncRNA 139对体外B淋巴细胞活化成熟过程的影响:1)慢病毒感染小鼠原代成熟B细胞,利用LPS刺激激活B细胞,流式细胞仪检测B细胞活化表面标志物CD86、CD69分子表达情况,分析lncRNA 139对B细胞活化能力的影响;2)CCK8法检测lncRNA 139对B细胞增殖能力的影响;3)CFSE荧光标记法检测lncRNA 139对B细胞分裂能力的影响;4)流式细胞仪检测浆细胞表面标志物CD138分子表达情况,分析lncRNA 139对B细胞分化为浆细胞能力的影响;5)ELISA检测B细胞培养上清液IgM、IgG含量,分析lncRNA 139对B细胞免疫球蛋白生成的影响;6)ELISA检测B细胞培养上清液IL-6、IL-10、TNF-α含量,分析lncRNA 139对B细胞产生细胞因子的影响;7)Annexin V-FITC/PI双染法,分析lncRNA 139对B细胞周期的影响。6、采用RT-PCR等实验初步探究体外lncRNA 139影响B细胞分化的作用机制。结果1、LncRNA 139显示极低编码潜能,在数据库中暂无注释,定位实验显示lncRNA139主要位于细胞核中。2、下调lncRNA 139表达,骨髓以及外周血中总B细胞比例没有明显变化,其中pre-B细胞比例增加,immature B细胞下降。3、下调lncRNA 139表达,脾脏中总B细胞比例降低,其中mature B细胞比例减少。4、下调lncRNA 139表达,在体外显著降低了活化B细胞比例;抑制B细胞增殖分裂能力;明显降低浆细胞比例;促进IgG抗体生成,而IgM抗体水平没有明显变化。5、下调lncRNA 139表达,在体外明显抑制B细胞炎性因子IL-6、TNF-a分泌,而抗炎因子IL-10没有明显变化。6、下调lncRNA 139表达,在体外明显影响B细胞周期分布,造成B细胞周期阻滞在G0/G1期。7、下调lncRNA 139表达,在体外明显降低B细胞终极分化转录因子Blimp-1表达。结论本课题前期通过文献数据库从海量的B细胞发育相关LncRNAs二代测序结果中筛选出表达趋势明显的lncRNA 139作为研究对象,通过计算编码潜能、数据库检索匹配,发现lncRNA 139是一个尚未被研究过的非编码RNA。体内实验结果显示,敲低lncRNA 139表达导致小鼠骨髓中pre-B细胞亚群比例增加,immature B细胞比例减少。小鼠脾脏淋巴细胞中总B细胞比例减少,其中mature B细胞比例降低。提示低表达lncRNA 139可能将B细胞发育过程阻滞在pre-B细胞阶段。体外实验结果显示,低表达lncRNA 139导致小鼠B细胞活化能力、增殖分裂能力、浆细胞形成能力显著降低,提示lncRNA 139可能推进B细胞体外活化成熟及分化过程。ELISA结果显示低表达lncRNA 139促进B细胞IgG抗体水平增加。B细胞相关细胞因子检测结果显示,低表达lncRNA 139抑制炎症因子IL-6、TNF-α分泌,而抗炎因子IL-10无明显变化,提示lncRNA 139具有调控B淋巴细胞细胞因子分泌的作用。进一步机制研究表明,lncRNA 139在体外可能通过调节Blimp-1表达而影响B细胞向浆细胞分化。上述实验结果表明lncRNA 139在B淋巴细胞发育及活化成熟过程中起重要作用。