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第一部分尿酸对PC12细胞内α-synuclein蛋白影响的实验研究目的评价尿酸对PC12细胞中α-synuclein(α-syn)蛋白的作用。方法建立慢病毒转染的过表达α-syn的WT-PC12细胞株(WT细胞)。在过表达α-syn的WT-PC12细胞中加入尿酸(0-200μmol/L),检测细胞活力及α-syn蛋白。建立鱼藤酮诱导的PD细胞模型,0-500n M的鱼藤酮作用12小时后检测α-syn蛋白。在鱼藤酮模型中,尿酸预处理1h,观察α-syn蛋白。在高分化PC12细胞中测定尿酸作用6h后,α-syn转录情况。为了观察尿酸对α-syn半衰期的影响,使用蛋白抑制剂CHX单独作用以及与尿酸共同作用0-12h,对比尿酸对α-syn半衰期的影响。结果200umol/L尿酸可以有效降低α-syn蛋白,这一结果在鱼藤酮模型中进一步得到验证。PCR检测到尿酸对α-syn m RNA无明显。对比蛋白合成抑制剂CHX(cycloheximide)单独作用,加入尿酸之后,α-syn的降解速度增加,进一步证明尿酸可以促进α-syn降解。结论尿酸可以促进PC12细胞中α-syn的降解。第二部分尿酸对PC12细胞内自噬的调控作用及机制研究目的探讨尿酸在PC12细胞中对自噬的调节机制。方法首先在PC12细胞中加入尿酸(0-200μmol/L),12小时后用Western blot检测p62、LC3蛋白。瞬时转染e GFP-LC3质粒,尿酸100μmol/L、200μmol/L作用后,对比空白对照组观察LC3点状荧光表达分布的状况。鱼藤酮作用PC12细胞,建立帕金森病细胞模型,观察LC3含量。在鱼藤酮模型中,分为对照组、鱼藤酮组(50nmol/L)、尿酸(100μmol/L)+鱼藤酮(50nmol/L)组、尿酸(200μmol/L)+鱼藤酮(50nmol/L)组,观察p62、LC3含量以及e GFP-LC3点状荧光。分别检测对照组、氯喹(30μmol/L)组、尿酸(200μmol/L)组、氯喹(30μmol/L)+尿酸(200μmol/L)组LC3含量。采用Western blot观察m TOR依赖通路蛋白m TOR和p70S6K及其磷酸化水平变化。结果尿酸(0-200μmol/L)作用之后,可以观察到胞内LC3含量呈剂量依赖性增加,同时胞内p62的含量也逐渐减少。在e GFP-LC3转染的PC12细胞中,与空载组相比,作用200μM尿酸组,在荧光显微镜下明显观察到绿色点状荧光增加。50 nmol/L鱼藤酮作用12h后可以发现LC3II水平明显下降,同时对细胞活力未有明显影响。在鱼藤酮模型中,100μmol/L及200μmol/L尿酸预给药1小时,尿酸可以逆转鱼藤酮导致的LC3下降及p62增加的现象。免疫荧光实验:与单独鱼藤酮作用组相比,预给药尿酸组e GFP-LC3荧光点的数量增加。30μmol/L CQ作用明显增加了胞内LC3II的水平,尿酸作用之后,LC3II含量较前明显增高。磷酸化的m TOR以及其下游的p70s6k含量在尿酸作用15分钟后开始增加,在30分钟时,增加最为明显。结论尿酸通过m TOR介导的自噬通路激活自噬。