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目的:沙眼衣原体(Chlamydia tromatis,Ct)是一种革兰阴性,具有独特发育周期的专性胞内寄生菌。Ct主要感染眼部、生殖道会引起致盲性沙眼以及不孕不育。目前,Ct在我国的发病率正逐年递增。尽管Ct危害严重,但其致病机制尚不清楚。研究表明Ct在感染过程中主要通过分泌毒力因子诱导宿主炎症反应进而引起Ct致病。因此,本研究通过检测Ct Glg A蛋白对人单核细胞(THP-1)诱导产生炎症因子的影响,并进一步明确Glg A蛋白诱导炎症反应的相关信号通路和作用机制,旨在阐述Ct致炎机制,为有效预防、治疗临床Ct感染提供实验依据。方法:1.构建p Ge X-6P-1-Glg A原核表达载体,25℃,0.5 m M IPTG(Isoprop-β-D-thiogalactopyranoside)条件下诱导表达Glg A蛋白。随后通过Western blot鉴定重组Glg A蛋白。2.15μg/m L Glg A刺激THP-1细胞,实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-q PCR)以及酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β和TNF-αm RNA转录以及蛋白表达水平。3.以0.1、1、5、10和15μg/m L Glg A刺激THP-1细胞,0、2、4、6、8、12、24、36 h,RT-PCR以及ELISA检测IL-8、IL-1β和TNF-αmRNA转录以及蛋白表达水平。4.采用髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88,My D88)负显性质粒(p De Ny-h My D88)转染至THP-1细胞中,以10μg/m L Glg A刺激THP-1细胞,RT-q PCR检测IL-8、IL-1β和TNF-αm RNA的转录水平,ELISA检测IL-8、IL-1β和TNF-α的表达水平。5.THP-1细胞转染TLR2(psi RNA-h TLR2)、TLR4(psi RNA-h TLR4)和TLR6(si RNA-h TLR6)特异性si RNA,RT-PCR以及ELISA检测IL-8、IL-1β和TNF-αm RNA转录以及蛋白表达水平。6.10μg/m L Glg A刺激THP-1细胞0、15、30、60、120和180 min后,收集细胞,Western Blot检测细胞内p38、ERK和JNK蛋白的磷酸化水平。7.p38抑制剂(SB203580)、ERK抑制剂(PD98059)和JNK抑制剂(SP600125)处理细胞后,Western Blot检测细胞内p38、ERK和JNK的磷酸化水平。随后,10μg/m L Glg A刺激THP-1细胞,q RT-PCR检测IL-8、IL-1β和TNF-αm RNA的转录水平,ELISA检测IL-8、IL-1β和TNF-α的表达水平。8.10μg/m L Glg A刺激THP-1细胞后,收集细胞上清,Western Blot检测细胞内IкBα的磷酸化,并通过间接免疫荧光检测NF-кB p65的核转位。结果:1.诱导表达的Glg A蛋白经SDS-PAGE以及Western blot可在25KDa的大小处出现明显的特异性条带。2.Glg A刺激THP-1细胞后,细胞内IL-8、IL-1β以及TNF-α表达显著升高,而IL-6,IL-10并无明显变化。3.5、10和15μg/m L Glg A刺激THP-1细胞8、12、24 h后,均能显著刺激细胞内IL-8、IL-1β和TNF-α的分泌,且呈浓度及时间依赖性。10μg/m L Glg A刺激THP-1细胞8h后IL-8、IL-1β和TNF-αm RNA的转录水平到达峰值,10μg/m L Glg A刺激THP-1细胞24 h后IL-8、IL-1β和TNF-α分泌水平达到高峰。4.负显性质粒(p De Ny-h My D88)转染至THP-1细胞中,Glg A刺激THP-1细胞,结果显示IL-8、IL-1β和TNF-αm RNA的转录以及表达水平均显著降低。5.si RNA-h TLR2、si RNA-h TLR4、si RNA-h TLR6转染后,Glg A刺激THP-1细胞,结果显示沉默TLR2和TLR4基因能够显著降低IL-8、IL-1β和TNF-αm RNA的转录以及表达水平,而沉默TLR6基因对细胞因子的分泌并无显著影响。6.Western Blot检测结果显示Glg A能够显著诱导ERK和JNK蛋白的磷酸化水平,但对p38的磷酸化无显著影响。7.p38抑制剂(SB203580)、ERK抑制剂(PD98059)和JNK抑制剂(SP600125)处理细胞后预处理细胞后,用10μg/m L Glg A刺激THP-1细胞。结果显示抑制ERK和JNK磷酸化能够显著降低IL-8、IL-1β和TNF-αm RNA的转录及表达水平,而抑制p38磷酸化对细胞因子的表达并无显著影响。8.Western Blot结果表明Glg A能够显著诱导细胞内IкB磷酸化水平。此外,间接免疫荧光结果显示Glg A同样能够显著诱导NF-кB p65核转位。结论:Ct GlgA蛋白能够通过TLR2/TLR4依赖MyD88途径激活ERK和JNK,以及下游NF-κB信号通路诱导THP-1细胞表达炎症因子IL-8、IL-1β和TNF-α。