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金属硫蛋白(MTs)是细胞胞内金属结合蛋白超家族中的一员,几乎存在于所有生物体中,有较低的分子量(<7000Da),分子内缺少芳香族氨基酸或组氨酸,并且能够通过半胱氨酸残基鳖合Zn、Cu或Cd等金属离子以达到解毒的目的。在哺乳动物体内MTs维持铜离子的动态平衡和清除自由基。金属硫蛋白根据物种种类被分为15个家族,四膜虫金属硫蛋白属于第7亚家族。嗜热四膜虫是第一个完成全基因组测序的纤毛类原生动物。目前,从嗜热四膜虫全基因组数据库分析发现其有5种金属硫蛋白基因：MTT1、MTT2、 MTT3、 MTT4和MTT5,然而它们编码蛋白的生理功能仍不清楚。为了了解不同MTs在四膜虫细胞内的功能,本课题以MTT1和MTT2为研究对象,首次对两种蛋白的结构和功能进行分析,获得结果如下：1MTT1和MTT2生物信息学分析MTT1基因编码162氨基酸的长链多肽,预测分子量为16.76kDa；而MTT2基因编码108氨基酸,预测分子量为11.17kDa,他们的分子量显著地高于其它高等真核生物。在Cys的排布模式上两者存在显著差别：MTT1主要包括Cys-Cys-Cys (CCC)和Cys-Cys (CC)结构,Cys排布方式与哺乳动物金属硫蛋白的a-domain相似；MTT2主要包括Cys-X-Cys (CXC)结构,Cys排布方式与哺乳动物金属硫蛋白的(3-domain相似。2MTT1和MTT2的表达分析通过实时定量PCR的方法分析了MTT1和MTT2在细胞对数生长期的表达,发现MTT2的表达量约是MTT1的32倍。同时观察了铜、镉、S02衍生物、高盐(NaCl)和饥饿初期等条件下二者表达的差异,MTT1能够被多种诱导物有效诱导表达,而MTT2对铜离子敏感。3MTT1和MTT2基因的克隆、突变和蛋白表达纯化通过PCR从四膜虫大核基因组克隆到MTT1和MTT2基因,通过定点突变将MTT1分子中的TAA和TAG突变为CAA和CAG,同时将MTT1和MTT2基因的N端突变：V4W (MTT1)和T3W (MTT2),然后将MTT1和MTT2连接pET28a表达载体构建重组表达质粒pET28a-MTT1和pET28a-MTT2,分别转化E. coli BL21(DE3)后经过1mM IPTG诱导表达,获得了MTT1和MTT2蛋白的包涵体,约占总蛋白的15-35%,包涵体溶解后经Ni2+亲和层析柱和Superdex75凝胶层析柱纯化得到目的蛋白。4MTT1和MTT2蛋白的分析利用荧光光谱研究MTT1和MTT2蛋白与二价重金属离子结合的特征发现,MTT1可以结合16个镉离子,MTT2可以结合11个镉离子；圆二色谱(CD)分析发现,MTs分子中半胱氨酸残基的排布形式影响着MTs与金属离子结合后的二级结构,带有独特“CCC”簇的MTT1和“CXC”簇的MTT2在结合镉离子之前二者蛋白质二级结构类似,均以无规则卷曲为主,而结合镉离子后Cd16-MTT1复合物中α-螺旋和β-转角占据优势,而Cd11-MTT2复合物却依然以无规则卷曲为主。5Cd16-MTT1和Cd11-MTT2的抗氧化能力将1mM的Cd16-MTT1和Cd11-MTT2复合物与低浓度NO(0.5mM)反应,经过傅里叶红外光谱扫描发现,有二硫键形成,证实了Cd16-MTT1和Cd11-MTT2复合物均具有抗氧化能力。6MTT1和MTT2的鳌合重金属能力利用紫外-可见光光谱对MTT1和MTT2结合第二副族(ⅡB)重金属离子的稳定常数进行了分析,MTT1和Cd2+结合有最大的稳定常数(KCd-MTTI=1.45×1020.45),和Hg2+结合的稳定常数次之(KHg-MTT1=2.47×1019.43),和Zn2+结合的稳定常数最小(KZn-MTT1=1.41×1016.60)；MTT2和Cd2+、Hg2+、Zn2+的稳定常数分别为KCd-MMT2=2.19×1018.10，KHg-MTT2=8.46×107.79, KZn-MTT2=1.41×1010.98.在Cu2+滴定Cd16-MTT1和Cd11-MTT2复合物的过程中发现,Cu2+不能有效替换Cd16-MTT1复合物中的镉离子,而Cu2+却能够置换Cd11-MTT2复合物中的镉离子。7三价稀土元素La3+对MTT1和MTT2的影响La3+在低浓度时(小于80u M)能够促进嗜热四膜虫细胞繁殖,而高于这个浓度反而抑制细胞繁殖,超过100μM后细胞破裂死亡；同时荧光光谱实验证实La3+可以进入四膜虫细胞；进入细胞内的La3+能够诱导MTTl和MTT2的表达,但MTTl的响应倍数(25倍)要高于MTT2(5倍)；荧光光谱实验也证实MTT1和MTT2蛋白可以与La3+发生结合反应以达到解除La3+毒性的作用。8MTT1和MTT2基因敲除细胞株的构建生物信息分析表明MTT1和MTT3串联排列,且Cys排列模式一致；MTT2和MTT4串联排列,Cys排列模式一致。为分析MTT1和MTT2在体内的功能,通过同源重组,构建了△MTT1-MTT3和△MTT2-MTT4基因敲除细胞株。相对于野生型细胞株,△MTT1-MTT3基因敲除细胞株繁殖速度较快,且对Cd2+更加敏感；而△MTT2-MTT4基因敲除细胞株繁殖速度变慢,对Cu2+更加敏感。本研究首次对具有不同一级结构特征的长链金属硫蛋白MTT1和MTT2进行了体外表达、纯化和光谱分析,证实MTT1被多种环境因素诱导并对镉离子具有强的亲和力。而Cu2+能够高效地诱导MTT2的表达并能够置换Cd11-MTT2中的Cd2+。说明金属硫蛋白中“CCC”簇与“CXC”簇的排布方式与离子结合存在一定的相关性,带“CCC”簇的MTT1更偏爱Cd2+,而Cu2+偏爱结合富含“CXC”簇的MTT2。因此,带有独特“CCC”簇的MTT1更多参与重金属离子的解毒,而带有“CXC”簇的MTT2可能主要参与生物体内Cu2+的代谢,进一步说明了不同MTs在细胞中执行不同的生理功能。本研究也首次证实了三价稀土元素La3+能促进四膜虫细胞繁殖,同时进入细胞并诱导MTTl和MTT2的表达,而MTT1和MTT2也可能通过天冬氨酸或谷氨酸上的O原子与La3+发生相互作用。MTTl和MTT2基因敲除实验进一步表明：两种不同的金属硫蛋白执行不同的生物学功能。