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背景:慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一种粒细胞增生性疾病,占成人白血病的20%。CML病人的主要病因是9号和22号染色体易位产生BCR-ABL融合基因,编码一个210k Da持续活化的酪氨酸激酶,诱导CML的产生。针对BCR-ABL开发的酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors,TKIs)类靶向药物(譬如Imatinib)取得了较好的临床疗效,已经取代骨髓移植成为首选治疗方案。但Imatinib并不能治愈CML,长期服用Imatinib容易引起BCR-ABL基因突变和耐药基因的高表达而对药物产生抗性,使CML从慢性期进入加速期,或转为急性白血病使病情难以控制,因此,阐明CML的耐药机制或发现新的药物靶点对未来CML的诊疗具有重要意义。ADP核糖基化因子(ADP-ribosylation factors,ARFs)是真核细胞中广泛表达且高度保守的GTP结合蛋白,是Ras超家族成员之一。先前的实验中,将Arf6进行干扰,降低K562细胞中ARF6蛋白的表达,发现K562细胞的增殖和耐药能力显著下降。所以我们初步推测ARF6在BCR-ABL诱导的CML中发挥着关键作用。ARNO(ARF nucleotide-binding-site opener)是目前报道最多的催化ARF6的鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factors,GEFs)。我们通过RT-PCR检测了RNA水平K562中ARF6活化所需的GEFs表达。在四种GEFs蛋白(Cytohesin 1、ARNO、Grp1和Cytohesin 4)中,ARNO的表达量明显高于其他蛋白,提示在CML中,起催化作用的可能也是ARNO。我们结合预实验的结果和国内外文献报道,对ARF6上游和下游的信号转导通路进行了归纳和预测,BCR-ABL通过磷酸化ARNO促进了ARF6的活化,介导下游信号通路,调控靶基因(c-myc、cyclin B1、p21、MDR1和TERT等)的表达,进而促进CML的增殖与耐药。为了验证这种推测,本课题构建了有ARNO突变体(Y6F、Y326F、Y381F、E156K)的真核表达载体,转染293T细胞,通过co-IP、Western blot等方法阐明BCR-ABL磷酸化ARNO促进ARF6活化的分子机制。另外用Secin H3(ARNO抑制剂)处理K562细胞,检测了ARNO对K562细胞耐药的影响。方法:1.利用点突变试剂盒构建ARNO突变质粒表达载体,和BCR-ABL表达载体共同转染293T细胞。2.利用co-IP、Western blot检测ARNO的磷酸化水平,ARF6-GTP 水平。3.Secin H3处理K562细胞,利用流式细胞术检测ARNO对K562细胞耐药的影响。结果:1.co-IP、Western blot结果显示在三种ARNO突变体中,Y326F突变体的ARNO磷酸化水平和Arf6-GTP较低,与阴性对照E156K相似,推测BCR-ABL磷酸化ARNO的326位酪氨酸进而活化ARF6。2.流式细胞术结果显示K562细胞经Secin H3处理后细胞凋亡率明显增加,对Imatinib的耐药性减弱,说明Secin H3抑制ARNO的活性后增强了Imatinib的药效,ARNO使K562对Imatinib的敏感性增强。结论:BCR-ABL磷酸化ARNO的326位酪氨酸进而活化ARF6;ARNO使K562对Imatinib的敏感性增强。