微生物的制药技术与微生物的代谢产物息息相关。而代谢工程是通过DNA重组技术的手段通过改变代谢流或者改变代谢途径,来提高代谢产物的含量或者产生新的代谢产物,以筛选出优良的工程菌株或细胞。目前DNA重组技术比较常用的为Red同源重组系统,基于Red系统的选择反选择系统可对基因进行无缝修饰(点突变、替换、删除),但是优秀反选择基因是有限的。本文通过对选择反选择系统以及Red重组系统进行定向进化,对基因工程编辑技术有很大的帮助,具有较大的理论研究意义和实际应用价值。目的 通过对kil基因的选择严谨性以及重组效率进行了分析,与目前最广泛使用的反选择基因sac B进行比较,构建一种新型的kil反选择系统。然后用含有高效的Red重组系统的p Sim6质粒将通过与新颖的tet/kil反选择系统这一技术的融合,提高了对基因无缝修饰重组效率。另外,对Red基因进行定向进化,提高MAGE(多重自动基因组工程)技术,从而极大地加快细胞进化的步伐。方法与结果 根据Khetrapal的方法对kil和sac B反选择进行严谨性分析,结果证明,在所有这些测试菌株的基因位点中,kil的选择严谨性高于sac B的2至28倍。当不同长度的外源ds DNA片段用于基因重组时,反向选择系统的重组效率要高于neo/sac B反向选择系统。但是,kil系统不能用于含有温度敏感的kil基因的宿主菌株。建议使用不含kil基因的质粒的Red系统与此系统联合使用。然后,将kil选择反选择系统与p Sim6质粒联用后,与kil选择反选择系统与p KD46质粒联用相比,其选择严谨性要更高、背景更低。进而我们对三个不同的大肠杆菌菌株W3110、MG1655、DH10B中的四个不同的非必需基因位点(lac I、dbpa、ack、glk)进行同源重组,将不同长度的外源基因片段500 bp、1000 bp、2000 bp对这些位点进行基因替换。结果表明与neo/kil反向选择系统比较,重组效率均有显著提高,并且随着外源片段的增长越明显。外源片段为1000 bp时,为neo/kil的1.2-2倍;外源片段为2000 bp时,为neo/kil的2.2-5倍。这些结果说明,两者联用后使无缝修饰操作省时、简便且重组效果较优,为大肠杆菌重组工程提供了更多的选择。另外,我们对Red基因进行定向进化,首先在大肠杆菌染色体上插入一个包含无义突变的抗性基因(卡那霉素抗性基因neo)。然后以大肠杆菌lac启动子为模板构建了不同梯度强度的启动子文库,通过对35个不同梯度强度的启动子活性分析以及对启动子文库进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳分析。从中挑选了最强(活性为最弱启动子1283倍)与较弱(活性为最弱启动子100倍)的启动子与野生的lac启动子(活性为最弱启动子500倍)作比较,构建了含有Red重组系统的从启动子强到弱的p RO38a、p RO38b、p RO38c三个质粒。对三个质粒的Red基因进行突变,分析突变后的质粒在修复neo基因的细菌数目。结果表明:突变Red基因后的质粒,修复卡那霉素抗性基因的菌落数要高于未突变Red基因的质粒。最强启动子启动的质粒,突变Red基因修复neo抗性基因的菌落数约为未突变的2倍;野生型启动子启动的质粒,突变Red基因修复neo抗性基因的菌落数约为未突变的3倍;最弱启动子启动的质粒,突变Red基因修复neo抗性基因的菌落数约为未突变的50倍。结论 综上所述,本文对新型反选择系统kil的选择严谨性进行了分析,其严谨性相当于优秀的tet-sac B反选择系统,通过对kil基因与不同质粒的联用,对大肠杆菌菌株的基因位点进行基因替换,证明了kil的高重组效率。此外,通过对Red基因进行随机突变,筛选出优秀的突变体。这些结果对基因工程编辑技术有很大的帮助,具有较大的理论研究意义和实际应用价值。