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人乳铁蛋白(hLTF)，也称人乳转铁蛋白，是乳汁中主要的铁结合蛋白，广泛分布于多种组织、细胞内，在调节机体免疫和机体内铁的平衡、促进细胞生长等方面具有重要作周。转基因动物生产重组人乳铁蛋白(rhLTF)的研究对人类健康有很重要的现实意义，具有广阔的市场前景和重要的理论价值。 转基因克隆动物是指将转基因动物技术与克隆动物技术相结合，以动物体细胞(包括动物成体体细胞、胎儿成纤维细胞等)为受体，将目的基因以DNA转染的方式导入能进行传代培养的动物体细胞，再以这些体细胞为核供体，进行动物的克隆。 本实验以此理论为基础，从乳腺特异性表达载体的构建、奶山羊乳腺上皮细胞(GMECs)系的建立、外源基因转染奶山羊乳腺上皮细胞、转染细胞株的建立等几个方面进行研究，建立了乳腺特异性表达转基因体细胞系，为下一步的转基因克隆动物的制备奠定了基础。 1 人乳铁蛋白基因乳腺特异性表达载体的构建 本实验利用实验室已有的人乳铁蛋白cDNA(2320bp)、牛a-S1酪蛋白(aS1-casein)5’端(6.3Kb)和3’端(1.5Kb)表达调控序列、Neo~r(700bp)、增强子、PolyA序列，构建了人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体afLF。人乳铁蛋白cDNA为从正常妇女乳腺细胞cDNA库中，利用高保真Taq酶PCR法扩增出，含信号肽序列和3’终止信号。牛a-S1酪蛋白系用PCR方法从牛基因组DNA中扩增出5’调控区(2.3Kb)和3’调控区(1.5Kb)，然后在5’端上游增加长约为4Kb牛酪蛋白基因的基因组DNA调控序列。增强子为本实验室以相应的质粒DNA为模板，经PCR扩增获得，含有ATG和Kozak保守序列。Neo~r基因来自本实验室保存质粒。 2 外源基因片段转染奶山羊乳腺上皮细胞及阳性细胞株的建立 山羊乳腺上皮细胞，采用乳腺组织块胶原酶消化法，DMEM／F12培养液培养，获得混杂的原代乳腺细胞，通过胰蛋白酶分步消化，经2-3代纯化，获得较纯化的山