论文部分内容阅读
Alpha3beta2烟碱型乙酰胆碱受体(α3β2 nAChR)是配体门控的阳离子通道,由三个β2亚基和两个α3亚基组成的异源五聚体,在中枢或外周神经系统中大量表达,在介导神经递质释放和突触间信号传导中发挥重要作用,并被α-芋螺毒素特异性阻断。研究发现,很多神经系统疾病的发病与nAChRs的功能异常有关,因此,研究nAChRs结构与功能对于治疗相关疾病十分重要。目前,α3β2 nAChR的门控机理尚不清楚,并且与α-芋螺毒素BuIA相结合的关键氨基酸残基尚不明确,因此我们通过同源建模及分子动力学(Molecular dynamics,MD)模拟以α4β2 nAChR为模板建立了α3β2 nAChR结构模型,并系统地研究了α3β2 nAChR与高效抑制剂BuIA结合后的构象转变。确定BuIA与α3β2 nAChR结合的关键氨基酸位点及与门控相关的关键氨基酸位点,并通过定点突变以及表达α3β2及其突变体的非洲爪蟾卵母细胞的电生理记录进行验证。总之,系统的研究了与BuIA结合的α3β2 nAChR结构的闭合状态,对于开发靶向nAChRs闭合状态的治疗性抑制剂具有重要意义。研究目的:通过研究BuIA结合α3β2 nAChR的拮抗机制,确定了α3β2 nAChR与BuIA结合的关键氨基酸及门控相关的关键氨基酸,揭示了α3β2 nAChR的三门控机制,为研究nAChRs分子机制提供实验依据,并为开发靶向nAChRs闭合状态的抑制剂提供实验依据。研究方法:1、通过同源建模模建了α3β2 nAChR的晶体结构模型,通过计算机模拟,系统的研究了α3β2 nAChR与高效抑制剂BuIA结合后的构象转变,确定了BuIA与α3β2受体结合的相关氨基酸及在受体跨膜区与门控相关的氨基酸。2、利用双电极电压钳(Two microelectrode voltage clamp,TEVC)技术,并通过定点突变和表达α3β2 nAChR及其突变体的非洲爪蟾卵母细胞的电生理记录来验证α3-E226、α3-Y221、β2-D196、BuIA-Y12是否为结合关键氨基酸,α3-L281、α3-V285、α3-L288、β2-L274、β2-V278、β2-L281是否为门控关键氨基酸。3、利用Western Blot验证外源蛋白在非洲爪蟾卵母细胞的表达量。研究结果:通过计算机模拟,确定了BuIA与α3β2 nAChR结合的相关氨基酸为BuIA-Y12、α3-E226、α3-Y221、β2-D196,其中BuIA-Y12是BuIA上的相关氨基酸,α3-E226、α3-Y221、β2-D196是α3β2上的相关氨基酸。α3β2 nAChR与门控相关的相关氨基酸为α3-L281、α3-V285、α3-L288、β2-L274、β2-V278、β2-L281。电生理实验发现乙酰胆碱(Acetylcholine,ACh)激活α3β2[D196S]和α3[E226A]β2作用变弱,量效曲线向右偏移;BuIA抑制α3β2[D196S]的作用与野生型α3β2相比没有明显变化,但是其抑制α3[E226A]β2作用减弱,量效曲线向右偏移;BuIA[Y12F]抑制α3β2 nAChR作用明显减弱,量效曲线右移。经过定点突变及电生理验证发现100μM ACh激活α3[L281A]β2、α3[V285A]β2、α3β2[L274A]、α3β2[L281A]、α3β2[L274A,L281A]、α3β2[V278A,L281A]电流比α3β2明显变大且有统计学差异,但是ACh激活α3β2、α3[L281A]β2、α3[V285A]β2、α3[V285A,L288A]β2、α3β2[L274A]、α3β2[V278A]、α3β2[L281A]、α3β2[L274A,L281A]、α3β2[V278A,L281A]的量效曲线没有明显差异,同时BuIA抑制α3β2、α3[L281A]β2、α3[V285A]β2、α3[V285A,L288A]β2、α3β2[L274A]、α3β2[V278A]、α3β2[L281A]、α3β2[L274A,L281A]、α3β2[V278A,L281A]的量效曲线也没有明显变化。Western Blot结果显示α3β2受体及其突变体的蛋白表达量没有显著差异。研究结论:1.BuIA的12位酪氨酸是与α3β2结合的关键位点,羟基通过氢键进一步提高亲和力,突变此位点量效曲线右移。2.α3-E226位点与BuIA的结合有关,突变此位点量效曲线右移。3.推测α3-E226、α3-Y221、β2-D196突变影响结合口袋局部构象,从而影响ACh与受体结合,导致ACh激活α3β2[D196S],α3[E226A]β2量效曲线右移,α3[Y221F]β2电流幅度减小。4.α3-L281、α3-V285、β2-L274、β2-L281是门控相关的关键位点,突变此位点不改变量效曲线偏移,但是电流幅度变大。5.门控位点突变结果揭示了α3β2受体存在三个门控,控制孔区的开放和关闭。