组织工程皮肤在临床皮肤再生修复、化学品安全毒理与功效测试以及皮肤疾病研究等领域均有重要的应用。特别是欧美动物替代测试的推广,已造成贸易壁垒,严重影响我国经济发展,迫切需要有效且简便的方法构建组织结构与功能与人体皮肤更加相近的组织工程皮肤。支架材料选择、支架制备、种子细胞与构建方法是组织工程皮肤构建的技术要点。成纤维细胞在支架中均匀分布、增殖生长、活性保持情况,角质细胞在支架上增殖与分化情况以及构建得到的组织结构完整性与功能等,都是全层皮肤构建成败的关键评价标准。基于天然原料生物相容性好,细胞毒性小等优点,我们在组织工程皮肤的构建中选用了海藻酸钠、壳聚糖、胶原、明胶和纤维蛋白作为支架材料。首先利用冷冻干燥法得到了海藻酸钠体积占比100%、60%与20%的海藻酸钠-壳聚糖多孔支架A1、A2和A3,用0.25%戊二醛、0.02M EDC/NHS交联和二次冻干法制得的胶原-壳聚糖支架B1、B2和B3及冷冻干燥后热交联得到明胶支架C1。通过吸水率与孔隙率测试、支架形貌结构观察及对接种成纤维细胞的支架的三维空间细胞分布与增殖情况进行对比,分析不同多孔支架的性能。最终选用吸水率和孔隙率分别大于80%和90%,表面孔径在70-150μm之间且成纤维细胞可在支架中均匀分布并增殖即性能最佳的明胶支架C1进行全层皮肤构建,获得了具有完整真表皮结构,全皮与表皮厚度分别在1000-1100μm之间与50-250μm之间且可正常表达表皮层标记蛋白角蛋白10的全层皮肤。由于冷冻干燥法获得的多孔支架在构建全层皮肤过程中,常需成纤维细胞分泌细胞外基质填充多孔结构后再接种角质细胞,构建周期较长且厚度大的真皮结构,成纤维细胞接种后较难分布均匀。进而我们基于成纤维细胞在不同浓度的纤维蛋白水凝胶的增殖和活性测试结果以及机械性能,最终选用浓度为5 mg/m L的纤维蛋白水凝胶进行全层皮肤构建,获得了具有完整真表皮结构且角蛋白10从第7天到第14天表达量不断上升的全层皮肤。最后我们利用纤维蛋白凝胶以及静电纺丝制得的可使角质细胞有效粘附、增殖与分化的明胶纤维支架,在PEGDA组织培养小室中进行全层皮肤构建。并对通过微流控芯片与自动培养系统构建流体环境,模拟体内养分供给与代谢产物去除的动态过程构建得到的全层皮肤与采用传统静态培养方式构建得到的全层皮肤进行组织结构与活性以及屏障功能形成情况的对比研究。实验结果表明培养八天后,两种构建方式均能获得具有完整真表皮结构的全层皮肤.第六天全层皮肤均保持组织活性,活细胞较多。动态构建相比静态构建方式获得的全层皮肤,死细胞少,但厚度相对较薄。从皮肤屏障测试可知,两种构建方式得到的全层皮肤第六天与第一天相比,阻值明显上升,均能得到具有一定皮肤屏障功能的全层皮肤。本研究通过不同支架构建得到的具有完整真表皮结构的全层皮肤,有很强的应用潜力,可进一步在皮肤再生修复、皮肤疾病的研究、药物筛选与化妆品安全毒理与功效评价等应用方向上开展研究。其中采用纤维蛋白凝胶作为支架对全层皮肤组织结构与功能的完善提供了有利的条件。动态环境构建全层皮肤的方法为进一步提升组织工程皮肤培养环境,开展皮肤相关的多器官共培养研究提供了有效的技术支撑。