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21三体综合征是常见的染色体非整倍疾病之一,主要临床表现为智力低下,多器官发育及功能异常,典型的面部特征等。其产前筛查及诊断作为产科医务工作者的重点研究内容。目前染色体核型分析技术仍然是产前诊断21-三体综合征胎儿的金标准[1],但需要采用有创伤性的方法获取胎儿细胞,如羊水穿刺、脐血穿刺或者获取绒毛组织,给孕妇及家属带来很多顾虑,不易被接受。近年来研究显示[2-4],母体外周血中存在胎儿游离核酸,这为无创性筛查胎儿染色体非整倍体异常提供了新途径。Poon等[5]研究发现,孕妇外周血血浆中来源于胎盘的胎儿特异性表达的PLAC4基因所编码的m RNA,为胎儿游离m RNA用于无创产前筛查21三体综合征提供了依据。MLPA-SNP技术是近年来产前筛查21三体综合征的新技术[6],运用母体外周血中胎儿特异的m RNA上的等位基因的多态性,对21三体综合征进行产前筛查。本研究通过DNA测序技术及PCR-RFLP技术,分析河南地区汉族人群21号染色体上PLAC4和COL6A2基因的10个SNP位点的基因型,筛选适合本地区人群的高杂合率SNP位点;检测孕8-16周孕妇外周血中的胎儿特异基因PLAC4和COL6A2 m RNA的表达量,分析无创性产前筛查的适宜孕周;选取该地区5个高杂合率SNP位点,采用RT-MLPA技术对40例标本进行检测。目的本研究通过分析中国河南地区汉族人群中21号染色体上PLAC4和COL6A2基因的多个单核苷酸多态性的特点,及胎儿游离m RNA在不同孕周的母体外周血中的表达水平。探讨逆转录-多重连接探针扩增技术用于该地区21三体综合征胎儿的无创性产前筛查的价值。材料和方法1实验材料①第一部分:随机选取2013年6月至12月在郑州大学第三附属医院体检门诊体检的患者500例,男女各250例,满足条件:籍贯河南省,汉族,既往体健,签署知情同意书后,留取其2m L外周静脉血置于EDTA抗凝管作为标本。②第二部分:随机选取门诊30例围产保健的健康孕妇,签署知情同意书后,分别在其怀孕8周、10周、12周、14周、16周,留取5m L外周静脉血置于EDTA抗凝管作为标本。③第三部分:选取我院羊水胎儿细胞染色体核型分析结果为21三体综合征阳性的孕妇20例为实验组,正常妊娠孕妇20例作为阴性对照组,告知并签署知情同意书后,留取其5m L外周静脉血置于EDTA抗凝管作为标本。2实验方法①第一部分:运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术和DNA测序技术,检测500例河南地区汉族人群中胎儿特异性基因PLAC4和COL6A2基因上10个SNP位点的基因型,计算其等位基因的杂合率;②第二部分:运用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应技术,测定30例孕妇在孕8周、10周、12周、14周、16周时的外周血中胎儿游离的PLAC4和COL6A2两种m RNA在5个不同孕周期的表达水平;③第三部分:运用逆转录-多重连接探针扩增技术对羊水胎儿细胞染色体核型分析结果为21三体综合征阳性的孕妇20例及正常妊娠孕妇20例,进行21三体综合征胎儿的无创性产前筛查。结果1.第一部分500例河南地区汉族人群中胎儿特异性基因上10个SNP位点杂合率分别为1)PLAC4基因:rs59066201(61.6%)、rs8130833(39.2%)、rs4818219(34.8%)、rs9977003(21.6%)、rs7844(19.2%);2)COL6A2基因:rs7717(49.6%)、rs1044598(53.4%)、rs559(50.2%)、rs3088026(12.8%)、rs1042917(45.6%):3)rs59066201等位基因杂合率在NCBI数据库上未见报道;与NCBI数据库报道相比较,rs8130833、rs9977003、rs7844位点等位基因杂合率有统计学差异(P<0.05),其他位点无统计学差异(P>0.05)。2.第二部分30例孕妇在孕8周、10周、12周、14周、16周时的外周血中均能检测到胎儿游离m RNA,表达量随孕周的增加而增加1)PLAC4 m RNA在5个孕周的表达水平依次为:7.22±1.05、8.02±1.41、9.51±1.69、11.33±2.11、13.31±2.58;2)COL6A2 m RNA在5个孕周的表达水平依次为8.95±1.28、11.19±1.36、15.0±1.58、16.87±1.72、18.96±2.79。3.第三部分选取5个杂合率比较高的SNP位点,采用RT-MLPA技术进行21三体综合征的产前筛查rs7717、rs559、rs1044598、rs59066201、rs1042917,在河南地区人群覆盖率达到[[1-(1-49.6%)×(1-53.4%)×(1-50.2%)×(1-61.6%)×(1-45.6%)]=97.6%],对20例21三体综合征胎儿孕妇及20例正常胎儿孕妇外周血标本进行21三体综合征的无创性产前筛查,有效筛查率达到87.5%,筛查准确率达到100%。结论1.本研究中的10个SNP位点中,rs7717、rs559、rs1044598、rs59066201、rs1042917位点的杂合率较高,人群覆盖率达到97.6%,可用于河南地区汉族人群21三体综合征的无创性产前筛查;2.胎儿特异性基因PLAC4和COL6A2 m RNA在孕妇外周血中均有表达,当胎儿特异性m RNA-SNP位点呈杂合状态时,运用RT-MLPA技术可以在孕8-16周进行无创产前筛查。