Zunongwangia profunda SM-A87荚膜多糖显微结构及抗菌肽对枯草芽孢杆菌抑菌机理的原子力显微镜研究

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微生物菌体纳米尺度表面分析是当今微生物学领域的重要研究内容,以原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)为主要技术手段,研究者能够得到微生物菌体及其表面附属物的超微结构图像,从而能够对生长过程中或药物处理后的微生物表面结构的细微变化进行研究。在表面结构成像的同时,利用AFM能够获得力谱曲线,进而检测微生物菌体的纳米机械性质等信息。   在本论文中,以AFM为主要技术手段,开展了以下几方面的微生物学研究:   1、荚膜的AFM观察方法及潮解水下荚膜检测技术的建立   已有的利用AFM对细菌荚膜进行检测的研究中,将在气相检测环境下发现的细菌细胞周围存在的液体状物质,报道为细菌的荚膜,然而最新的关于荚膜形貌研究的报道指出这些液体状态的物质并非细菌的荚膜,而是缓冲液在细菌周围形成的潮解水,对于荚膜在AFM下的真实结构及在有潮解水存在的情况如何检测荚膜结构需要进一步的研究。我们利用AFM对深海细菌Zunongw angia profundaSM-A87的附属结构一荚膜进行了检测,在单糖链分辨率水平上观察到了荚膜的组织结构,建立了荚膜的AFM检测方法。另外,我们发现利用AFM的“ScanAsyst”成像模式,在有潮解水覆盖菌体的情况下,也能检测到荚膜结构,从而建立了在有潮解水存在的情况下荚膜的检测技术。   2、不同培养温度下,Zunongwangia profunda SM-A87菌体个体荚膜多糖产量及荚膜结构变化过程的研究   对10℃和30℃两个温度下培养的菌体生长情况和产糖量随时间的变化进行了检测,同时使用AFM方法,对不同培养时间的菌体表面的荚膜结构进行了观察。当培养温度为10℃时,菌体表面荚膜多糖产量较多。当细菌生长到对数生期时,菌体表面的荚膜多糖厚度增加,稳定期时荚膜厚度达到最大值。当培养温度为30℃时,多数细菌呈现成串生长现象,杆状的细菌较多,荚膜的结构多数也为片层结构和分散的网络结构共存,产糖量较少。   3、细菌荚膜多糖结构在不同保温温度下随保温时间的变化   通过分离、提纯等各步骤,得到纯度较高的Z.profunda SM-A87荚膜多糖(EPS-A87)。利用AFM,观察不同保温温度下,随保温时间延长该多糖结构的变化,发现经保温处理后,多糖发生不同程度的聚集。   4、细菌与抗生素Trichokonin VI相互作用的过程中,表面结构及纳米机械性质的变化   利用AFM,我们检测了一种从拟康氏木霉Trichoderma pseudokoningii SMF2中提取的Peptaibol类抗菌肽—Trichokonin VI与枯草芽孢杆菌Bacilhts subtilis的相互作用。Trichokonin VI对B.subtilis的抑菌效果显著,最小抑菌浓度(minimalinhibition concentrtion,MIC)为25 mM。AFM观察结果表明Trichokonin VI对B.subtilis的作用表现出时间和浓度的依赖性。经Trichokonin VI处理后,细胞壁塌陷,菌体表面的粗糙程度增加。另外,检测Trichokonin VI对B.subtilis细胞膜通透性的影响表明膜的通透性发生了改变,这一结果表明Trichokonin VI的作用机制很可能是其引起B.subtilis细胞内物质外流,进一步导致细胞形貌及纳米机械性质发生改变。本研究中,我们利用AFM观察了Trichokonin VI处理B.subtilis后,细菌的形貌变化过程,并结合其他经典的生物学实验,揭示了Trichokonin VI对革兰氏阳性细菌的抑菌机理。
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