显花植物的雌雄配子体,也叫胚囊和花粉,分别含有雌配子卵细胞和雄配子精细胞。它们分别产生于雌蕊的胚珠和雄蕊的花药中。在植物开花时,成熟的花粉被传递到雌蕊的柱头上,经识别后萌发出管状的花粉管,花粉管侵入柱头,并在雌蕊组织中极性生长,最终进入胚珠的胚囊中,并释放其携带的两个精细胞进行双受精。花粉管在雌蕊中的极性生长是把精细胞传送到雌配子体中完成受精所必需的,是植物有性生殖的重要步骤。维持花粉管在雌蕊中的正常生长受到花粉管与雌蕊互作机制的调控,但目前对花粉管与雌蕊组织互作调控花粉管极性生长的机制研究还很少。CrRLK1L亚家族是一类RLK,参与细胞间的信号传导;并且,它们因可能参与雌雄互作而倍受关注,但目前,关于CrRLK1L在花粉管与雌蕊互作并极性生长中所起的作用了解甚少。本论文分析和鉴定了花粉和花粉管表达的CrRLK1L亚家族RLKs在花粉管体内生长中的作用和机制。首先利用拟南芥资源网提供的芯片数据分析了 CrRLK1L亚家族17个成员的表达模式,鉴别出五个候选的花粉管表达CrRLK1L基因:分别是已有报道在花粉管生长中起重要作用的ANX1和ANX2、有报道在根中起重要作用的CAP1基因和两个功能未知的CrRLK1L PRO（TEIN CLP）基因CLP1和CLP2。Real-time PCR分析显示,CLP1和CLP2在花粉中有比较高的表达,而CAP1在花粉中的表达量比较低。启动子活性分析和GFP标记分析显示,CLP1和CLP2在花粉中高表达;CLP1和CLP2蛋白在成熟花粉和花粉管中表达,并定位在花粉管顶端区域的质膜。这些结果表明,CLPs是在花粉管中表达并定位于花粉管顶端区域质膜上的RLKs。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别敲除CLP1和CLP2基因,获得了单突变体clp1-1、clp1-2、clp2-1、clp2-2及双突变体clp1-1clp2-1和clp1-2 clp2-2。这些突变体都在相对应的CLP蛋白胞外域中,发生了单一碱基缺失或插入的点突变,导致CLP蛋白在胞外范围内提前出现翻译终止密码子,造成CLP蛋白翻译提前终止。clp1突变体结实率正常,而clp2结实率明显地降低,clp1 clp2双突育性降低的表型没有明显地比clp2加重。遗传分析显示,clp1的雌雄配子的传递率正常:clp2雌配子体功能也正常,但clp2雄配子传递率则严得下降;并且clp1可以轻度地加重clp2雄配子遗传传递率低的表型。所有clp突变体花粉的形态发育、花粉活力、花粉核型发育和体外萌发生长都与野生型的无明显差异。突变体花粉管在雌蕊中萌发生长时,clp1花粉管可以进入引导组织,花粉管表面出现凸起和粗细不均匀,但不影响受精;而clp2花粉管虽然也能进入花柱,但出现严重的去极性现象,肿胀和变粗,不能进入引导组织,导致不能完成受精。突变体互补实验表明,clp突变体的花粉管在雌蕊中极性生长异常的表型是由CLP基因功能缺失引起的。此外,CLP1的显性负效应突变体也有类似于clp2的强表型。这些结果表明,CLP基因在维持花粉管在雌蕊正常极性生长中起重要作用,而且CLP2的作用大于CLP1。Y2H和BiFC实验显示,CLP1和CLP2蛋白都可以与RopGEF1或RopGEF12互作,而且在植物细胞检测体系中,CLP与GEF互作的位置与质膜标注信号共定位。实验也显示,RopGEF1和 RopGEF12 分别可与ROP1、ROP3、ROP5 或 ROP9 互作。此外,CLP1 和 CLP2 与 RopGEF1或RopGEF12的自我磷酸化区域互作,而ROP1、ROP3、ROP5或ROP9与RopGEF1或RopGEF12的PRONE结构域互作,暗示CLPs、GEF和ROP有可能形成复合体。Y3H实验也显示,CLP1或 CLP2、RopGEF1 或 RopGEF12 与 ROP1、ROP3、ROP5 或 ROP9 能形成复合体。此外,Y2H和BiFC实验也显示,CLP1能与CLP2互作形成异源聚合体,而CLP2还可以形成同源聚合体,它们的互作位置也都定位在质膜。综上所述,CLP基因在调控花粉管在雌蕊组织中的极性生长起重要作用。CLP蛋白可能参与花粉管与雌蕊组织的互作,并可能通过与ROP信号途经互作调控花粉管在雌蕊中的极性生长。这些研究结果可为进一步深入研究花粉管与雌蕊组织互作调控花粉管在雌蕊中的极性生长机理提供新的线索。