氮化硅(Si3N4,SN)作为一种合成的非氧化物生物陶瓷,具有良好的生物相容性和优良的成骨活性。通过骨肉瘤细胞和人成骨细胞样MG63细胞的体外实验证实SN具有良好的表面生物活性,可显著促进细胞反应(如增殖和分化),SN植入物的化学和光谱分析表明,硅和氮元素在成骨细胞的作用下沉积在天然羟基磷灰石的晶格中SN不仅具有良好的生物相容性,而且具有良好的骨传导性,在体内具有良好的成骨能力。硅和氮的存在可以刺激体内前体细胞分化,促进成骨细胞活性,最终加速新骨的形成。多孔硅、硅/二氧化硅纳米颗粒和硅取代羟基磷灰石己被开发用于骨再生,它们都显示出硅增强成骨活性的共同机制。氮(N)是一种互补元素,对蛋白质合成、骨生长和组织再生起到至关重要的作用。聚醚醚酮(peetheretherketone,PK)是一种半结晶的热塑性聚合物,具有良好的生物相容性、机械强度和与人骨相似的弹性模量,已发展成为骨科和牙科领域的骨植入物。然而,PK的生物惰性特即无成骨活性,不能与宿主骨结合,因此降低了植入物的初始固定性和长期稳定性。多孔生物材料允许骨组织生长,在早期成骨过程中显示良好的初始稳定性。因此,在PK中加入孔隙结构可以促进新骨组织在多孔结构中的生长,从而与宿主骨形成更多的生物锚定,从而提高种植体的稳定性,是一种促进成骨和与宿主骨结合的策略。在骨愈合过程中,成骨总是伴随着血管生成,良好的血供和血管生成能力是骨再生的必要条件。寻找一种局部促进多孔种植体血管生成的方法也是设计骨修复用新型生物材料的一个挑战。本研究首先使用聚醚醚酮(PK)为基体材料,采用冷压烧结和粒子析出(Nacl)的方法制备了大孔结构PK(PPK),然后使用悬浮涂层和熔融结合的方法创新性的在PPK表面制备了具有生物活性的SN涂层的新型骨修复材料多孔聚醚醚酮氮化硅涂层生物材料(CSNPPK)。本研究的目的是利用大孔结构和生物活性SN涂层(CSNPPK)促进血管化和成骨。系统评估了 CSNPPK对MC3T3-E1细胞体外行为的影响,以及对CSNPPK在体内血管化、成骨和骨整合的影响。分析CSNPPK的表面特征和结构组成等相关因素与修复骨缺损之间的关系,探索CSNPPK促进骨长入、加速骨整合的机理,为发展新型具有特殊功能的骨植入材料提供新思路与新方法。本研究分为三个部分:第一部分旨在研究CSNPPK的制备与体外表征检测;第二部分旨在研究CSNPPK对MC3T3-E1细胞体外行为的影响;第三部分旨在研究CSNPPK体内血管化、成骨和骨整合的影响。第一部分多孔聚醚醚酮氮化硅涂层生物材料的制备与体外表征检测研究目的:CSNPPK的制备,研究其表面形貌、化学组成、孔径大小、孔隙率、抗压强度、吸水性能、离子释放性能和PH值变化。研究方法:首先通过冷压烧结和盐析的方法制备大孔PK(PPK),然后采用悬浮涂层和熔融结合的方法在PPK(CSNPPK)表面制备了具有生物活性的SN涂层。选用实片PK(DPK)、多孔PK(PPK)为对照组,多孔聚醚醚酮氮化硅涂层(CSNPPK)为实验组。使用扫描电镜(scanning electron microscopy,SEM;S-4800,Hitachi,Tokyo,Japan))背散射电子相观察各组材料的表面形貌;X线衍射射仪(X-ray diffraction,XRD,D/MAX 2550 VB/PC,Rigaku Co.,Japan)、红外光谱仪(FTIR,Nicolet 6700,Nicolet,U.S.A.)和 EDS(EDS,S-4800,Hitachi,Japan)能谱分析各组材料的化学组成;采用3D激光显微镜(VK-X 110,Keyence Co.,Japan)分析各组材料的表面粗糙度;使用万能材料试验机(Instron-3345 U.S.A.)测量多孔材料PPK和CSNPPK的抗压强度。使用CTAn程序(Skyscan Company,Belgium)测量PPK和CSNPPK的平均孔径,采用水浸泡法分析材料PPK和CSNPPK的吸水性能和孔隙率;将各组样品浸入模拟体液(SBF)溶液中,用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES,U.S.A.)于不同时间(1、3、7、10、14和28天)测量硅离子的浓度变化。并在每个时间点(6、12、24、72和168小时),使用平板膜微电极(PB-10,Germany)测定材料在模拟体液的pH数值。研究结果:扫描电镜显示CSNPPK表面有大量的微/纳米级的氮化硅颗粒均匀分布;XRD、FTIR和EDS分析均显示有氮化硅成分;3D激光共聚焦显微镜分析显示聚醚醚酮形成多孔结构表面其粗糙度明显提高,氮化硅的加入其粗糙度提高到最大;材料的吸水性结果表明氮化硅的加入CSNPPK吸水率(476.8±23.1%)较PPK(411.7±10.5%)增加了;PPK和CSNPPK的平均孔径分别为347.0±27.6μm 和 339.0±31.2μm,CSNPPK 的孔隙率(68.2±2.6%)较 PPK(71.4±3.1%)无明显下降。CSNPPK 的抗压强度(7.7土1.4mpa)高于 PPK(6.8±1.9mpa)。离子释放实验表明CSNPPK可有持续释放少量的硅离子。Si离子浓度从1到14天表现为持续升高,随后14到28天相对稳定,Si离子浓度在28天左右稳定在3.4 mg/L左右。从6至168小时,PH值变化也表现为略有增加,在168小时测定PH值约7.5。研究结论:通过悬浮涂层和熔融结合的方法成功的在大孔PK表面制备了具有生物活性的SN涂层。通过对样品的XRD、FTIR和EDS分析,在CSNPPK大孔表面观察到SN组分。加入氮化硅后,CSNPPK的表面粗糙度、吸水率、抗压强度比PPK提高,但孔径大小、孔隙率没有明显变化。离子释放实验表明,CSNPPK在1～28天内可连续释放少量硅离子,在6～168小时内PH值略有升高。第二部分多孔聚醚醚酮氮化硅涂层生物材料体外细胞相容性实验研究研究目的:研究CSNPPK对MC3T3-E1细胞体外行为的影响。研究方法:体外细胞相容性实验选用MC3T3-E1细胞与材料进行共培养,选用实片PK(DPK)、大孔PK(PPK)为对照组,CSNPPK为实验组。应用以下方法评估材料的体外骨生物活性:应用CCK-8((CCK-8 Dojindo,Kumamoto,Japan))用于测定6、12小时时的MC3T3-E1细胞在各组材料上粘附性和1、4、7天时的细胞增殖。使用扫描电镜(SEM)和激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察24小时的细胞在各组材料上的黏附与形态变化;通过碱性磷酸酶(ALP)染色及其定量(时间点7、14、21天)和茜素红染色及其定量(时间点28天)分析MC3T3-E1细胞在各组材料上的成骨分化能力;应用实时聚合酶链反应(PCR)定量检测各组材料上细胞成骨分化相关基因碱性磷酸酶(ALP)、1型胶原(COL1)、骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(OCN)的mRNA表达。研究结果:CCK-8结果表明12小时CSNPPK上的细胞数明显高于PPK和DPK上的细胞数;CSNPPK细胞相对增殖率在第4天和第7天明显高于DPK和PPK组;SEM显示:24小时,DPK表面的细胞呈球形,而PPK和CSNPPK表面的细胞呈扁平状。此外,与PPK和DPK相比,CSNPPK上有更多的细胞贴壁和铺展;荧光染色结果显示:24小时,与PPK和DPK相比,有更多的MC3T3-E1细胞在CSNPPK黏附和细胞骨架充分铺展;ALP染色及其定量和茜素红染色及其定量分析表明各时间点CSNPPK细胞ALP染色面积及ALP活性均高于PPK和DPK组;28天时,CSNPPK组的茜素红染色面积和矿化结节均高于PPK和DPK组;实时定量PCR实验研究显示:第7天,CSNPPK上细胞ALP和COL1的表达高于DPK和PPK。第14天,CSNPPK的ALP、COL1和OPN的表达高于DPK和PPK。21天时,CSNPPK组的4个基因表达量均高于DPK和PPK。研究结论:CSNPPK不仅具有良好生物学活性,而且能有效促进MC3T3-E1细胞的粘附、铺展、增殖、成骨分化和成骨相关基因的表达。第三部分多孔聚醚醚酮氮化硅涂层生物材料体内动物性研究研究目的:研究CSNPPK体内血管化、成骨和骨整合的影响。研究方法:体内实验采用兔子股骨髁骨缺损模型,将DPK、PPK和CSNPPK材料植入股骨髁骨缺损处。分别在时间点4周和8周时,我们通过X线和Micro-CT(micro-CT,Scanco Medical,uCT-80,Switzerland)对植入物的样本观察骨缺损修复情况。对脱钙样本进行显微CT成像,以评估材料的血管形成情况。同时,采用血管内皮生长因子(VEGF)免疫组化方法检测血管生成情况。组织学标本用H&E染色,Masson三色镜下观察新骨形成的组织学特征。用荧光标记法研究材料在体内骨愈合过程中新骨的形成率。组织切片用Van Gieson染色观察新骨形成。各组材料在植入后8周,使用万能材料试验机(Instron-3345 U.S.A.)进行一次推出试验,以评估样本的骨整合情况。研究结果:在第4周和第8周时,X线、Micro-CT均显示与对照组材料相比多孔聚醚醚酮氮化硅生物材料上有较多量的新生骨长入;DPK未有血管形成,CSNPPK的血管形成多于PPK;在4周和8周时,在DPK周围发现一些疏松的结缔组织,部分新生骨生长到PPK和CSNPPK的大孔中,其中CSNPPK的新生骨含量高于PPK;植入后4周和8周VEGF免疫组化染色结果发现CSNPPK的VEGF染色面积明显高于PPK;植入后4周和8周,通过荧光和定量分析标记新生骨区域的组织学图像结果表明,CSNPPK的新生骨面积高于PPK和DPK;Van-Gieson染色新生骨的组织学图像结果表明,CSNPPK的NB面积大于PPK和DPK;植入后8周,推出实验证明CSNPPK的推出负载明显高于PPK和DPK。研究结论:CSNPPK动物体内增强新生骨组织和新生血管的生成,具有较好的促进骨/植入物界面骨整合作用。