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目的探讨降钙素相关肽α基因(calcitonin related polypeptide alpha,CALCA)多态性及其甲基化状态在氟暴露致女性骨密度改变中的作用,以及基因-环境交互作用对成年女性骨密度的影响。材料与方法1.调查对象的选择于2017年在河南省开封市饮水型氟病区开展一项横断面研究,根据当地水氟监测数据,整群抽取地方性氟中毒村和对照村18～60岁在当地出生或居住5年以上的女性人群作为调查对象,分别进行问卷调查、体格测量、骨密度测量及生物样本收集。按照纳入排除标准筛选后,共计722人纳入研究。2.生物标志的测定采用超声骨密度仪测定调查对象左脚跟骨骨密度,得到T值用于描述骨密度,根据世界卫生组织骨质疏松的诊断标准对调查对象进行分组:-1.0≤T<1.0为骨质正常,-2.5<T<-1.0为骨量流失,T≤-2.5为骨质疏松。将骨密度T值与骨质分组作为结局变量进行后续分析。采用氟离子选择电极法测定尿氟含量,使用火焰原子吸收分光光度计检测血清钙、镁含量;利用甲基化特异荧光定量PCR测定CALCA基因第一外显子区甲基化状态;TaqMan探针和Real-time PCR检测CALCA rs1553005和rs2956多态性位点的基因型。3.数据处理调查数据通过Epidata3.0录入并使用SPSS 21.0进行分析。主要统计方法有:两独立样本t检验、χ2检验、单因素方差分析、多重线性回归、二项Logistic回归和广义多因子降维法,检验水准α=0.05。结果1.调查对象基本特征以及骨密度相关血清学指标分析本研究共纳入调查对象722人,尿氟浓度>1.6 mg/L的调查对象占23.7%(171/722)。骨质正常、骨量流失及骨质疏松的调查对象分别占9.0%(65/722)、57.6%(416/722)和33.4%(241/722);不同骨质分组间的分布特征比较显示,年龄、BMI分布差异均有统计学意义(P<0.05);血清镁、HDL-C、ALP和CALCA基因第一外显子区甲基化水平在3组间分布差异具有统计学意义(P<0.05)。2.氟暴露对女性骨密度的影响校正相关混杂因素之后结果显示,随着尿氟水平的改变,人群骨密度未发生显著改变(β=0.01,95%CI:-0.03,0.05)。分层分析显示,50-54岁女性人群尿氟与骨密度呈负相关(β=-0.06,95%CI:-0.12,0.00)。3.氟暴露对女性CALCA第一外显子区甲基化的影响校正相关混杂因素后回归结果显示:随着尿氟的改变,CALCA第一外显子区甲基化水平未发生显著改变(β=0.27,95%CI:-0.62,1.16)。分层分析显示,在40-44岁女性人群中,尿氟与CALCA第一外显子区甲基化水平呈正相关(β=4.95,95%CI:1.16,8.74)。4.CALCA第一外显子区甲基化水平及其基因多态性与女性骨密度的关系(1)CALCA第一外显子区甲基化水平与女性骨密度呈负相关(β=-0.004,95%CI:-0.010,-0.001);分层分析显示,两者的负相关在45岁以上人群中较为明显,尤其在45-49岁、55-60岁女性人群中(分别P<0.05)。Logistic回归结果显示:以骨质正常组为参照,CALCA甲基化水平每增加1%,调查对象发生骨质疏松(OR=1.012,95%CI:1.000,1.020)的风险增加 1.2%。(2)以携带rs1553005位点CC基因型的调查对象为参照,携带CG(β=-0.169,95%CI:-0.309,-0.035)和 CG+GG(β=-0.139,95%CI:-0.268,-0.011)基因型调查对象的骨密度T值均下降;Logistic回归结果显示,携带CG、GG基因型的调查对象发生骨量流失的风险分别增加2.02倍、1.19倍。(3)以携带rs2956位点AA基因型的调查对象为参照,携带AT基因型和TT基因型的调查对象发生骨量流失以及骨质疏松的风险未发生显著改变(P>0.05)。5.环境-基因交互作用对女性骨密度的影响广义多因子降维法分析未观察到CALCA第一外显子甲基化及基因多态性和氟暴露对女性骨密度的影响存在交互作用。进一步进行年龄分层探索氟暴露和CALCA第一外显子甲基化及基因多态性对骨密度的交互作用,结果发现在45-49岁女性人群中,CALCA第一外显子甲基化与氟暴露存在对骨密度的交互作用(P<0.05);氟暴露和rs2956位点多态性对骨密度的影响存在交互作用(P<0.05)。结论(1)氟及CALCA第一外显子甲基化对女性骨密度的影响具有年龄特异性。氟暴露和CALCA第一外显子甲基化交互作用可影响女性骨密度,45-49岁女性人群CALCA第一外显子甲基化较高的调查对象骨密度更易受到氟暴露的影响。(2)与CC基因型相比,成年女性携带CALCA基因rs1553005位点CG、GG基因型发生骨量流失的风险分别增加2.02倍和1.19倍。氟与CALCA基因rs2956位点多态性存在交互作用,45-49岁女性人群携带CALCA基因rs2956位点AT和TT基因型骨密度更易受到氟暴露的影响。