人偏肺病毒(Human metapneumovirus,HMPV)可造成儿童、免疫力低下成年人和老年人呼吸道感染。研究表明,人偏肺病毒的流行历史至少为65年,几乎每个幼儿在5岁之前都曾经感染过HMPV。当病人感染该病毒时,其主要的症状包括发烧、咳嗽、流鼻涕,严重者会引起更严重的肺炎和支气管炎。人偏肺病毒是肺病毒科,偏肺病毒属,是单股负链RNA病毒。人偏肺病毒的F基因和N基因在4个亚型中是相对保守的基因,因此,它们常被用作病毒检测的靶基因。目前对于该病毒的检测方法主要有传统RT-PCR法、免疫荧光检测法和荧光定量PCR检测法。在本次实验中,通过比对4种不同亚型的病毒的全长F基因序列,在其保守的部分,设计了一对PCR引物,理论扩增序列长度为526bp。运用传统的RT-PCR方法对所获得的临床咽拭子样本或细胞培养物进行检测。同时我们合成了526bp长的序列并插入到克隆载体中作为阳性对照模板。通过琼脂糖凝胶电泳分析,可确定标本是偏肺病毒核酸阴性或阳性,该方法扩增效率相对较高、简单快速,通过进一步测序验证和比对可确定样本是否含有偏肺病毒。由于病毒分离是病毒检测的金标准,然而目前国内外并没有成熟统一的病毒培养方法,因此我们参照国内外相关研究,利用青岛地区和广州地区的咽拭子样本或细胞培养物样本进行病毒培养方法的优化和摸索。我们分别在TPCK浓度和细胞株选择上进行了优化分析,最终选择了LLCMK2细胞以及1 μg/ml的胰酶处理病毒感作中的细胞,并按照以上方法成功将广东地区HMPV核酸阳性的样本在细胞上进行了P1至P4的传代,然而青岛地区HMPV核酸阳性的样本并未成功适应细胞。我们推测原因主要是,其一待培养样本中病毒载量低且病毒不稳定易丢失,其二细胞培养方法和体系仍需进一步优化。研究表明偏肺病毒的G基因在4个亚型之间变异较大,被用作分型的依据。因此本研究中通过在G基因两端保守区设计PCR引物并扩增全长(理论长度为942bp)。通过RT-PCR,我们从4个待检样本(包括临床咽拭子和细胞培养物)分别扩增出4条全长G基因,并测序,通过与Genbank中国大陆地区的80条G基因参考序列比对,建立了进化树,结果发现来自青岛的3个样本中其中2个为A2亚型,1个为B1亚型,另外来自广州的1个样本为A2亚型,而进化树中的参考序列中65%为A2亚型,表明A2亚型仍是中国大陆地区分布最广的人偏肺病毒的。本研究中,通过设计10对简并引物,利用RT-PCR扩增方法,对样本进行偏肺病毒全基因组序列扩增和测序,将测序结果拼接并得到约13kb的序列,目前遗留基因组中3’端的约100 bp和5端的约200 bp仍未测通。为了研究该病毒的不同基因间序列对于病毒转录的调控作用,我们构建了4个双顺反子微基因组质粒,该质粒包含上游和下游两个报告基因,基因区之间含有不同的间区。以上间区分别是病毒基因组中的NP基因间区(包含N基因的gene end区和P基因的gene start区以及特有的调控序列)、FM2基因间区、M2SH基因间区和GL基因间区,这些间区序列代表了人偏肺病毒全基因组中的前、中、后的转录起始位点止位点,并进一步分析它们在转录调控中的机制。通过与辅助质粒(即病毒N、P、L和M2-1表达质粒)转染BSRT7/5过程细胞,检测报告基因的瞬时表达水平,并,分析不同基因间序列对于病毒的转录效率的影响。结果发现,不同偏肺病毒的的GE序列可能对转录终止活性有影响,不同的GS序列与聚合酶结合并启动转录效率不同。然而病毒基因组具体的转录调控机制仍需进一步研究,本研究构建的微基因组系统可提供便利的研究工具。