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背景益气活血药黄芪、人参、当归、川芎、三七是导师治疗胸痹心痛的临床经验用药。本课题组前期网络药理学研究发现钙调蛋白激酶(calmodulin dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)是益气活血药治疗心肌缺血性疾病的主要作用靶点之一。并给予心梗大鼠益气活血药对其进行药物干预后,CaMKⅡ基因表达下降,从而推测CaMKⅡ可能作为益气活血药治疗心肌缺血性疾病的重要作用靶点。多项研究提示CaMK Ⅱ信号转导途径在心肌肥大的发生发展过程发挥着关键性的作用。故可以推测益气活血药对心梗大鼠心肌细胞肥大的调节过程中,CaMKⅡ可能是一个关键性的调控靶点。目的本研究旨在观察益气活血药对心肌梗死大鼠心肌细胞肥大和CaMKⅡ分子靶点的影响,并探讨益气活血药对心梗大鼠心肌细胞肥大的影响是否与CaMKⅡ-HDAC4-MEF2C 通路有关。方法运用结扎左冠状动脉前降支的方法构建心肌梗死大鼠模型并将其分为模型组、益气活血组、培哚普利组、假手术组。假手术组只穿线不结扎。各组分别于术后第二天灌胃给药,用药组分别给予相应药物(临床等效剂量),假手术组与模型组给予无菌蒸馏水灌胃。同时设置7天、28天两个时间节点观察并检测相关指标的变化。小动物超声检测各时间节点心梗大鼠心肌结构和功能的变化。HE染色并用光学显微镜观察各组大鼠心肌组织结构的变化和心肌细胞肥大情况。用蛋白质印迹法(Western Blotting,WB)检测心肌梗死边缘区CaMK Ⅱ,p-CaMK Ⅱ,细胞浆内CaMK Ⅱδ,细胞核内CaMK Ⅱδ,HDAC4,p-HDAC4的蛋白表达情况。采用免疫荧光法检测HDAC4定位表达情况。实时荧光定量法(RT-PCR)检测MEF2CmRNA的表达。结果实验一,益气活血药对心梗大鼠心功能的影响。小动物超声检测各组大鼠心功能情况:与假手术组相比,模型组大鼠左室射血分数(Left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室短轴收缩率(Left ventricular fractional shortening,LVFS)明显降低(P<0.01,P<0.05),左室收缩末期容积(Left ventricular end systolic volume,LVESV)、左室舒张末期容积(Left ventricular end-diastolic volume,LVESV)、左室收缩末期内径(Left ventricular internal dimension systole,LVIDs)、左室舒张末期内径(left ventricular end diastolic diameter,LVIDd)显著升高(P<0.01)。术后7天,与模型组相比,各给药组LVEF、LVFS均显著升高(P<0.05)。术后28天时,各给药组与模型组相比,LVEF、LVFS显著升高(P<0.01);LVEDV、LVESV显著降低(P<0.01);益气活血组LVIDs、LVIDd显著低于模型组(P<0.01)。结果表明,心梗大鼠左心室扩张,收缩功能降低,心功能明显降低。而用药组能明显减轻心梗大鼠的左室扩张状态,改善心梗大鼠的心功能。实验二,益气活血药对心梗大鼠心肌组织形态学及心肌细胞肥大水平的影响。HE染色通过光镜观察各组大鼠心肌细胞组织形态学变化,心梗大鼠梗死边缘区心肌细胞肿胀,排列紊乱,炎症细胞浸润增多,心肌纤维走形中断。而用药组与模型组相比心肌细胞肿胀减轻,排列较整齐,炎症细胞浸润明显减轻。测量心肌细胞横截面形态学参数结果:模型组大鼠心肌细胞横截面面积、周长和平均直径均高于假手术组(P<0.05)。术后7天,与模型组相比,益气活血组心肌细胞横截面面积、周长和平均直径均降低(P<0.01,P<0.05);培哚普利组横截面面积和周长与模型组相比降低(P<0.05)。术后28天,各用药组与模型组相比面积、周长和平均直径均降低(P<0.01,P<0.05)。结果表明心梗大鼠梗死边缘区心肌组织结构严重破坏,心肌细胞肥大。益气活血药和培哚普利均能能明显减轻心梗大鼠心肌组织结构的破坏,改善心肌细胞肥大状况。实验三,益气活血药对CaMKⅡ分子靶点的影响。检测心肌梗死边缘区CaMKⅡ,p-CaMK Ⅱ,细胞浆CaMK Ⅱδ,细胞核CaMK Ⅱδ的蛋白表达情况。CaMKⅡ蛋白表达:术后7天,模型组大鼠与假手术组相比CaMKⅡ蛋白表达升高(P<0.01),各给药组与模型组相比CaMKⅡ蛋白表达降低(P<0.01,P<0.05)。术后28天各组之间差异均无统计学意义。p-CaMKⅡ蛋白表达:模型组大鼠p-CaMKⅡ蛋白表达均显著高于假手术组(P<0.05)。术后7天,益气活血组低于模型组(P<0.01),而培哚普利组与模型组差异无统计学意义。术后28天,用药组均低于模型组(P<0.01)。CaMKⅡδ在胞浆、胞核的蛋白表达情况:术后7天,模型组大鼠CaMKⅡδ在胞核的表达显著高于假手术组(P<0.01),且用药组与模型组相比均显著降低(P<0.01),而各组之间CaMKⅡδ胞浆表达差异无统计学意义;术后28天,与假手术组相比,模型组CaMKⅡδ在胞浆、胞核的蛋白表达均增加(P<0.01),且用药组均显著低于模型组。结果表明,心梗大鼠CaMKⅡ蛋白表达及磷酸化活化水平均增高,尤以磷酸化水平增高更为明显。CaMKⅡ在心脏表达的主要亚型CaMKⅡδ在心梗大鼠胞核、胞浆中表达均增加,早期以胞核表达增加为主。益气活血药能够抑制其异常表达。CaMK Ⅱ在心梗大鼠呈现高表达高活性状态。而益气活血药和培哚普利对其表达和活性均产生了一定的抑制作用。实验四,益气活血药对心梗大鼠CaMKⅡ下游HDAC4和MEF2C表达的影响。HDAC4蛋白表达:在7天、28天时,模型组大鼠HDAC4表达均高于假手术组(P<0.01),用药组与模型组相比有所降低但差异无统计学意义。p-HDAC4蛋白表达:7天时,模型组大鼠p-HDAC4蛋白表达显著高于假手术组(P<0.01),同时用药组大鼠表达量显著低于模型组(P<0.01)。28天时,模型组、益气活血组、培哚普利组大鼠p-HDAC4表达显著高于假手术组(P<0.01)。益气活血组与模型组相比减低(P<0.01),培哚普利组与模型组相比有所降低但差异无统计学意义。HDAC4免疫荧光检测:假手术组HDAC4基本位于胞核内,而模型组则主要在胞浆中表达。而用药组介于两者之间,在胞核胞浆均有一定量的表达。MEF2C mRNA表达:7天、28天模型组大鼠MEF2C mRNA均显著高于假手术组(P<0.01)。用药组与模型组相比MEF2CmRNA表达显著降低且差异有统计学意义(P<0.01 或 P<0.05)。本实验研究表明心梗大鼠HDAC4及其磷酸化活化水平明显增高,其磷酸化水平增高从而使其从胞核移出进入胞浆。导致其对MEF2C的抑制作用减弱,MEF2CmRNA表达明显升高。益气活血药明显抑制HDAC4的磷酸化水平进而导致MEFF2C基因表达水平降低,最终将抑制心肌肥厚基因的表达。结论1.益气活血药能够有效改善心梗大鼠心脏结构和功能的变化。2.益气活血药能够抑制心梗大鼠CaMKⅡ分子靶点的异常表达以及其磷酸化活化水平。3.益气活血药可能通过抑制CaMKⅡ-HDAC4-MEF2C通路的异常病理信号传导改善心梗大鼠心肌细胞肥大。