研究背景心血管疾病尤其冠状动脉粥样硬化性心脏病(Coronary heart disease, CHD)是目前大多数发达国家首要的死亡原因。动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是CHD的主要病理基础。目前研究认为,AS是一种血管受损后慢性炎症免疫过程。来自Framingham Heart Study等研究资料证实,血脂异常、糖尿病、高血压、吸烟、年龄、性别等是CHD发生的独立危险因素。“损伤反应”学说认为：导致CHD的各种主要危险因素最终都损伤动脉内膜,而粥样硬化病变的形成是动脉对内膜损伤作出反应的结果。在AS形成过程中,包含多种细胞因子及炎症介质的参与。单核细胞穿过动脉内皮层进入内膜是启动AS病变形成的早期事件之一。单核细胞在整合素、选择素、选择素配体等作用下粘附于内皮细胞,单核细胞趋化蛋白1 (Monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)趋化单核细胞穿越内皮层。单核细胞与内皮细胞结合后相互作用并产生白细胞介素-6 (Interleukin-6, IL-6)、血小板源生长因子(Platelet-derived growth factor, PDGF).巨噬细胞集落刺激因子(Macrophages colony stimulating factor, M-CSF)等大量细胞因子,这些因子均能刺激平滑肌细胞的迁移与增殖、活化巨噬细胞,同时分泌MCP-1、IL-6、细胞间粘附分子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)、干扰素(Interferon, IFN)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor, TNF)等炎症因子,吸引更多单核-巨噬细胞集中、粘附于内皮受损区域,增加炎症细胞浸润。局部聚集的巨噬细胞吞噬脂质后形成泡沫细胞,进一步促进了AS的进展。AS斑块中含有大量炎性免疫细胞包括单核巨噬细胞、T细胞、肥大细胞,多呈活化状态,它们可分泌细胞因子、促血栓分子、蛋白酶、血管活性物质等,这些都可影响损伤处的炎症过程和血管功能。所以说炎症反应产生的一系列级联瀑布效应,最终导致AS斑块及血栓的形成。研究证实,在人体以及小鼠模型,单核细胞穿过动脉内皮层进入内膜从而启动AS,而T淋巴细胞更是贯穿了AS斑块的每个发展阶段。目前关于AS病理过程中的炎症免疫调控机制仍不完全清楚。共刺激分子B7家族与CD28家族以配体/受体的形式传递正性或负性信号,为T淋巴细胞活化、抑制及微调提供第二信号,如B7-1与CD28作用能刺激并维持T细胞效应,而与细胞毒性T淋巴细胞抗原4(Cytotoxic T lymphocyte antigen 4, CTLA-4)作用则起到抑制T细胞效应的作用。B7/CD28家族中存在许多能削弱T淋巴细胞应答并促进T淋巴细胞耐受的抑制性信号通路,在调控及维持T淋巴细胞上刺激性与抑制性信号的平衡起到了关键性作用。新近发现的程序性死亡因子-1(Programmed cell death-1, PD-1)及其配体(Programmed cell death ligand, PD-L)通路是B7/CD28家族的新成员,由于其在免疫应答中发挥了独特作用,而被认为是微生物感染以及自身免疫耐受的重要调节因子。PD-1/PD-L路径不仅能以多种途径影响自身免疫耐受,而且能双向调节抗原递呈细胞与T细胞之间的相互作用。PD-1(又称CD279)属于免疫球蛋白超家族成员,含有两个酪氨酸信号基序的胞质区,胞内区含有酪氨酸抑制性基序。PD-1诱导表达于激活的CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK-T细胞、B细胞和单核细胞。PD-L2(又称CD273)是PD-1的配体之一,研究认为其在树突状细胞、单核细胞上表达。PD-1分别与PD-L1和PD-L2结合,从而调控T淋巴细胞的免疫反应。传统观念认为：PD-L2与受体PD-1分子结合后,通过募集具有酪氨酸磷酸酶活性及SH2结构域的蛋白分子而产生负调节信号,从而抑制T淋巴细胞的增殖以及细胞因子的分泌。但也有研究证明PD-1/PD-L可增强T细胞的活化,甚至有学者提出PD-1/PD-L的信号可能是双向的。PD-1/PD-L信号的平衡是维持体内免疫稳态的关键。就炎症性疾病而言,PD-1/PD-L可通过抑制T细胞的应答,从而抑制炎症反应、减轻炎症损伤。而在AS疾病的发生发展中,PD-L2的作用如何,目前研究较少,尚无明确的结论。炎症与免疫在AS的发生、发展过程中起到了重要作用,适当的抗炎、免疫调节可能会对AS疾病的发生、发展及转归产生重要影响。羟甲基戊二酰辅酶(3-hydroxy-3-Amethylglutaryl coenzyme A, HMG-Co A)还原酶抑制剂即他汀类药物,是治疗AS最常用的降脂药物,可减少AS多种并发症的发生。以往观点认为其通过减少肝脏胆固醇的合成,引起低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein cholesterol, LDL)受体表达增强,使血浆LDL清除增加,而发挥其调脂作用。近期研究证实他汀类药物除调脂外还具有其他多重作用,如：抗炎、抗氧化、调节免疫、稳定斑块、抑制血小板聚集和血栓形成、改善内皮功能、抑制血管平滑肌细胞增生、抗肿瘤等作用。关于其抗炎、调节免疫等功效已经在多种疾病如人类风湿性关节炎、人多发性硬化、小鼠自身免疫性神经脊髓膜炎等方面得到验证。他汀对AS的免疫调节作用和PD-L2之间有无关联,值得进一步研究。目的1.通过检测不同类型CHD患者外周血单核细胞上PD-L2的表达情况,探讨其与IL-6、MCP-1、高敏C反应蛋白(High sensitivity C-reactive protein, hs-CRP)等炎性因子的联系以及在AS形成中的作用。2.探讨不同浓度辛伐他汀(Simvastatin, SIM)对体外培养的经促炎因子INF-γ(Interferon-gamma, IFN-γ)干预后的正常人外周血单核细胞PD-L2表达的影响,为他汀类药物抗AS治疗提供一定的理论依据。方法第一部分：依据2007年AHA/ACC指南关于冠心病的诊断标准,排除自身免疫性疾病、急慢性感染性疾病、严重肝肾功能不全、近3月内服用他汀类药物、免疫抑制剂或类固醇药物者。连续收集经冠状动脉造影检查确诊为急性心肌梗死(Acute myocardial infarction, AMI)患者30例、不稳定型心绞痛患者(Unstable angina pectoris, UAP)30例、稳定型心绞痛患者(Stable angina pectoris, SAP)30例、冠状动脉造影检查正常的对照组26例的外周血。应用流式细胞术及实时荧光定量聚合酶链式反应(Real time Quantitative polymerase chain reaction, RQ-PCR)检测单核细胞PD-L2的蛋白及mRNA表达；应用酶联吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA)检测血清IL-6、MCP-1浓度,免疫比浊法检测血清hs-CRP浓度。第二部分：收集15例健康志愿者外周血,将同一位志愿者分离提纯的外周血单核细胞同时随机分为6个组：①第一组加入等体积磷酸盐缓冲液(Phosphate-buffered saline, PBS)溶液为对照组;②第二组加入等体积100U/ml IFN-γ为IFN干预组(SIM 0组);③第三组加入100U/ml IFN-γ培养4小时后再加入1×10-6mol/LSIM(SIM1组);④第四组加入100U/ml IFN-γ培养4小时后再加入等体积5×10-6mol/LSIM (SIM 5组);⑤第五组加入100U/ml IFN-γ培养4小时后再加入等体积10×10-6 mol/L SIM (SIM 10组)；⑥第六组加入100U/ml IFN-γ培养4小时后再加入等体积50×10-6 mol/L SIM (SIM 50组)。分组后各组单核细胞的培养、观察时间均为48h。48h后应用流式细胞术检测各组单核细胞PD-L2的表达情况。统计学方法：流式细胞术结果(%)、RQ-PCR结果(△Ct)和ELISA结果(pg/mL、μg/L)等计量资料以x±s表示,多组间比较采用One-Way ANOVA。多重比较,方差齐采用LSD,方差不齐采用Dunnett’s T3。PD-L2与IL-6、MCP-1、hs-CRP的相关性采用Pearson直线相关分析及多元线性逐步回归法。采用配对t检验对同一入选对象的对照组及IFN-y干预组(SIM 0组)PD-L2的表达进行统计学分析；不同浓度辛伐他汀对单核细胞PD-L2蛋白表达的影响,采用Two-Way ANOVA,多重比较,方差齐采用LSD,方差不齐采用Dunnett’s T3。所有统计学处理均采用SPSS 13.0统计软件进行分析。P<0.05表明差异有统计学意义。结果1.与对照组比较,SAP组、UAP组、AMI组患者外周血单核细胞PD-L2蛋白表达(分别为：(10.73±1.61)%,(12.38±1.94)%,(16.15±2.35)%,(20.48±2.51)%)明显增加,差异有统计学意义(F=116.958,P<0.001)；组间多重比较结果显示：UAP组比SAP组表达增加,AMI组比UAP组表达增加,差异均具有统计学意义(P<0.001)。2.与对照组比较,SAP组、UAP组、AMI组患者PD-L2mRNA分别为：1.38,2.46,3.27倍,差异有统计学意义(F=74.112,P<0.001)。组间多重比较结果显示：UAP组与SAP组、AMI组与UAP组差异具有统计学意义(P<0.001)。3.与对照组比较,血清IL-6、MCP-1、hs-CRP浓度在SAP组、UAP组、AMI组患者表达升高,差异有统计学意义(F=79.625; F=203.982; F=378.000; P<0.001)。4.与对照组比较,SAP组血清hs-CRP差异无统计学意义(P=0.683), UAP组、AMI组差异有统计学意义(P<0.001)。UAP组与SAP组比较,血清IL-6、MCP-1、hs-CRP浓度升高,差异有统计学意义(P<0.001),AMI组与UAP组比较,血清IL-6、MCP-1、hs-CRP浓度均升高,差异有统计学意义(P<0.001)。5.CHD患者PD-L2蛋白与血清IL-6、MCP-1、hs-CRP浓度呈显著正相关,相关关系较密切(r=0.563; r=0.736; r=0.778; P<0.001)。6.纳入年龄、性别、吸烟、收缩压、舒张压、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白-C、空腹血糖、体重指数、hs-CRP、MCP-1、IL-6等因素,运用线性逐步回归法分析,hs-CRP、MCP-1对PD-L2有显著性影响(F=80.221,P<0.001)。7.与对照组比较,IFN-γ干预后PD-L2蛋白表达升高,差异有统计学意义(t=18.215,P<0.001)。8.SIM1组、SIM 5组、SIM 10组、SIM 50组PD-L2表达逐渐下调,差异有统计学意义(F=26.306,P<0.001)。9.SIM 0组与SIM 1组差异无统计学意义(P=0.088), SIM 1组与SIM 5组,SIM 5组与SIM 10组,SIM 10组与SIM 50组间比较差异均具有统计学意义(P=0.032；P=0.014；P=0.012)。结论1.冠心病患者中,随着炎症程度的增加,外周血单核细胞PD-L2的表达亦增加。2.冠心病患者中,血清IL-6、MCP-1、hs-CRP等炎性因子浓度明显升高,以不稳定型心绞痛组、急性心肌梗死组升高尤为明显。3.促炎因子IFN-γ可促进体外培养的正常人外周血单核细胞上的PD-L2的表达,而辛伐他汀可下调促炎因子IFN-γ对其的上调表达。4.共刺激分子PD-L2与其受体PD-1结合后对T淋巴细胞的细胞增殖作用及对促炎、抗炎等细胞因子的分泌影响,以及在AS的动物模型上两者结合后的免疫调控机制及其信号转导通路尚需进一步研究。