第一部分上调表达PCK1对黑色素瘤再生细胞糖酵解侧枝反应的促进作用研究目的：肿瘤干细胞在肿瘤的发生、发展和治疗后复发过程中发挥重要作用。关于肿瘤细胞代谢的研究主要集中在混合细胞群体的层面,缺乏特异性针对肿瘤干细胞代谢特征及其分子调控机制的研究。本研究采用三维软纤维蛋白基质胶(3D fibrin)分离筛选的肿瘤干细胞(定义为肿瘤再生细胞,TRCs)为模型,探究糖异生的关键酶之一的胞浆型磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK1)在黑色素瘤再生细胞中的表达及其发挥的代谢功能。方法：(1)以3D fibrin分离小鼠黑色素瘤B16细胞、肝癌H22细胞、淋巴瘤EL4细胞中的TRCs,然后使用RT-PCR、Real time PCR和Western blot检测这些TRCs和相应对照细胞以及小鼠未分化的间充质干细胞(mMSCs)和胚胎干细胞(mESCs)中PCK1的表达。(2)使用癌症基因数据库cbioportal中的基因表达数据分析PCK1与CD133、ALDH1A1和ABCG5等常用肿瘤干细胞标志在多细胞中的共表达关系；并采用Real time PCR检测PCK1在CD133+与CD133-B16细胞亚群中的表达差异。(3)免疫组化检测PCK1在9例人黑色素瘤临床标本中的表达；分离人原代黑色素瘤新鲜标本中的TRCs, real time PCR检测PCK 1的表达情况。(4) RT-PCR和Western blot检测B16TRCs中糖异生的另外两个关键酶FBP1和G6Pase的表达情况,以探讨PCK1是否介导糖异生的反应。(5)以siRNA沉默PCK1的表达后,观察B16 TRCs体外生长、葡萄糖消耗、乳酸释放以及中间代谢产物(如丝氨酸／甘氨酸,三磷酸甘油)等的变化,以探究PCK1发挥的代谢功能。(6)以siRNA沉默B16或H22 TRCs中PCK1的表达,观察其在动物体内成瘤能力。(7)以siRNA沉默B16 TRCs中PCK1的表达后,补充相关中间代谢产物,以观察对克隆生长的影响。(8)观察PCK1过表达对B16 TRCs体外生长的影响。(9)构建PCK1启动子控制的EGFP荧光表达B16细胞,分离出该细胞中的TRCs并置于普通硬质环境下连续培养,采用荧光显微镜动态观察荧光变化；将B16 TRCs置于普通硬质环境下连续培养,以RT-PCR、Real time PCR和Western blot检测PCK1的表达变化。(10)以小分子抑制剂或封闭抗体阻断B16 TRCs中相关信号通路位点后以Real time PCR检测PCK1的表达,初步探究PCK 1的表达调控机制。(11)亚硫酸氢盐测序法检测B16 TRCs中PCK1启动子区的甲基化水平,探讨DNA甲基化对PCK1表达调控的影响。结果：(1)B16细胞、H22细胞、EL4细胞TRCs相对于分化的肿瘤细胞上调表达PCK1,未分化的小鼠间充质干细胞和胚胎干细胞高表达PCK1。(2)PCK1与常用肿瘤干细胞标志CD133、ALDH1A1和ABCG5在多细胞中的表达呈正相关；PCK1在CD133+B16亚群细胞中的表达高于CD133-亚群细胞。(3)约1/3的黑色素瘤临床标本中检测到PCK1的高表达,分离自人原代黑色素瘤的TRCs上调表达PCK1。(4)B16 TRCs不表达糖异生的另外两个关键酶FBP1和G6Pase。(5) siRNA沉默PCK1表达后,B16 TRCs体外生长明显受抑,葡萄糖消耗和乳酸释放减少,甘氨酸和三磷酸甘油水平下降。(6) siRNA沉默PCK1表达后,B16和H22 TRCs的小鼠体内成瘤能力均减弱。(7)补充甘氨酸和(或)三磷酸甘油可部分逆转PCK1沉默后B16 TRCs受抑制的生长。(8)PCK1过表达可促进B16 TRCs的体外生长。(9)硬基质环境培养可诱导B16 TRCs中PCK1的下调表达。(10)抑制整合素αVβ3或P13K信号可诱导B16 TRCs中PCK1的表达下调,H3K9去甲基化可导致PCK1表达增加。(11)B16 TRCs和对照细胞中PCK1启动子均呈高度甲基化。结论：黑色素瘤再生细胞相对于分化的肿瘤细胞上调表达PCK1,因缺乏FBP1和G6Pase的表达,PCK1在肿瘤再生细胞中并不介导完整的糖异生,而是通过促进糖酵解的侧枝反应以增强肿瘤再生细胞中间代谢产物的合成。干扰PCK1的表达可以抑制黑色素瘤再生细胞的体外生长和体内成瘤能力。这些研究揭示PCK1上调表达是黑色素瘤再生细胞重要的代谢标志之一,有可能作为黑色素瘤治疗的一个新的靶点。第二部分PCK1、PCK2在乳腺癌肿瘤再生细胞中的表达研究目的：探究PCK1、PCK2在乳腺癌肿瘤再生细胞(TRCs)中的表达情况。方法：(1)采用三维软纤维蛋白基质胶(3D Fibrin)分离筛选MCF-7、T47D以及MDA-MB-231等人乳腺癌细胞株中的肿瘤再生细胞(TRCs),以RT-PCR检测PCK1在这些TRCs以及对照细胞中的基因表达。(2)以Western blot检测PCK1, PCK2在MCF-7、T47D、MDA-MB-231等来源TRCs以及相应的对照细胞中的表达变化。结果：(1)在MCF-7、T47D、MDA-MB-231等乳腺癌来源的TRCs和对照细胞中检测不到PCK1的基因表达。(2) MCF-7、T47D、MDA-MB-231等乳腺癌来源的TRCs相对于对照细胞上调表达PCK2。结论：乳腺癌再生细胞不表达PCK1而是上调表达其线粒体型的同工酶PCK2。PCK2上调表达可能是乳腺癌再生细胞重要的代谢特征之一,可为设计特异性针对乳腺癌肿瘤干细胞的抑制策略提供靶点。然而,关于PCK2的具体代谢功能还有待于进一步阐明。第三部分 PCK2偶联谷氨酰胺代谢途径调控乳腺癌肿瘤再生细胞的增殖研究目的：以乳腺癌MCF-7细胞为模型,探究丙酮酸羧化酶(PC)对PCK2上调表达的肿瘤再生细胞(TRCs)的生物学意义,并从葡萄糖和谷氨酰胺代谢偶联的角度对乳腺癌TRCs的细胞代谢特征进行新的诠释和探索。同时,我们尝试通过联合干扰PCK2和PC或谷氨酰胺裂解途径来抑制TRCs的肿瘤治疗新策略,为进一步研究肿瘤再生细胞的脂质代谢打下基础。方法：(1)使用三维软纤维蛋白基质胶筛选分离乳腺癌MCF-7细胞中的TRCs,以酶学方法和高效液相色谱分别检测MCF-7 TRCs和对照细胞葡萄糖和谷氨酰胺的利用效率,探究葡萄糖代谢与谷氨酰胺代谢的偶联。(2)观察无谷氨酰胺培养基培养的MCF-7 TRCs体外生长情况以研究TRCs对谷氨酰胺的依赖程度。(3)以Western blot检测丙酮酸羧化酶(PC)、谷氨酰胺转运蛋白(SLC1A5)、谷氨酰胺裂解酶(GLS)以及异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)在MCF-7 TRCs和普通MCF-7细胞中的表达。(4)分别以siRNA联合干扰PCK2与PC、PCK2与GLS、PCK2与IDH2在MCF-7 TRCs中的表达,观察并统训MCF-7 TRCs克隆的体外生长情况。结果：(1)MCF-7 TRCs目对于普通MCF-7细胞消耗更多的葡萄糖和谷氨酰胺。(2)当剥夺了培养基中的谷氨酰胺,MCF-7 TRCs的克隆大小和数量急剧下降。(3)MCF-7 TRCs相对于对照细胞除上调表达PCK2外,还同时上调表达PC、SLC1A5和IDH2。(4)联合干扰PCK2与PC、PCK2与GLS或PCK2与IDH2较沉默单一位点对TRCs的抑制效果更明显。结论：在PCK2上调表达的乳腺癌MCF-7 TRCs中,为了补充线粒体内草酰乙酸的消耗以维持柠檬酸的合成,TRCs通过上调表达丙酮酸羧化酶以增加丙酮酸生成草酰乙酸的量。另外,TRCs还可通过增加谷氨酰胺的代谢来直接补充柠檬酸。通过PCK2上调可能介导的甘油骨架的合成增多以及谷氨酰胺裂解途径增强的脂肪酸代谢,TRCs可合成更多的脂类物质以满足其旺盛的代谢需求。联合靶向PCK2和PC或谷氨酰胺裂解途径可能是非常有潜在应用价值的针对肿瘤再生细胞的乳腺癌治疗新策略。