布鲁氏菌病（简称布病）是由布鲁氏菌引起的一类动物源性疾病,是重要的人畜共患病。布鲁氏菌病在世界各地都有广泛流行。布鲁氏菌是布鲁氏菌病的病原体,能引起人类的波浪热、慢性感染和哺乳动物的睾丸炎和流产等。该病一旦发病,需要经过长期的、多种抗生素的治疗才能消除症状。该病发生后容易转为慢性,无法根治。动物的布鲁氏菌病导致重大的经济损失,人布鲁氏菌病使病人丧失劳动力,给病人带来极大的痛苦。另外,由于布鲁氏菌容易汽溶胶化,可能被用于生物武器研制和制造生物恐怖事件,因此,它也是生物反恐的重要对象。鉴于布鲁氏菌危害的严重性,建立快速有效的检测方法是十分必要的,是布鲁氏菌病早期诊断和疾病控制的关键。布鲁氏菌的实验室检测主要是基于细菌学、血清学和核酸为基础的方法。细菌培养不适于布鲁氏菌的快速检测,其原因是传染性强和分离时间长。布鲁氏菌的血清学检测主要是通过试管凝集和玻片凝集等方法实现的,该方法具有一定的假阳性和假阴性率,ELISA等方法在敏感性和特异性上有一定提高,但是仍没有合适的诊断抗原用于特异诊断。血清学方法的另一个不足是无法区分自然感染和疫苗免疫的动物血清。PCR方法因不需要操作活菌,并且敏感性和特异性均很高,可用于布鲁氏菌属和种型的鉴定与检测。以上这些方法在布鲁氏菌的检测中发挥了并且正在发挥着重要作用,但是,这些方法共有的不足是需要在实验室进行,需要专门的仪器设备,并且检测所需要的时间较长,很难在现场进行快速检测分析。免疫层析技术是一种非常适合现场快速检测的技术,虽然它的敏感性和特异性均不如上述几种方法的高,但是它具备不需要特殊仪器、检测快速、操作简单等优点,在传染病的快速检测方面应用广泛。基于上转换发光技术（UPT）的免疫层析技术,是一种基于新型标记物的快速定量检测技术,与传统的免疫层析技术相比,具有敏感性高、能够定量的优势,在传染病病原的快速检测方面显示出了很好的应用前景。根据宿主范围的不同,布鲁氏杆菌分为9个种:B. melitensis（来源于山羊和绵羊）、B.abortus（来源于牛）、B. suis（来源于猪）、B. ovis（来源于绵羊）、B. canis（来源于狗）、B. neotomae（来源于沙鼠）、Brucella pinnipedialis来源于鳍足类),Brucella microti（来源于田鼠,Microtus）,Brucella ceti（来源于大的海洋生物,包括鲸和海豚）。其中羊种、牛种和猪种能够感染人,对人的危害更为显著。本研究运用UPT技术,研制能够检测各种感染人和动物的布鲁氏菌的免疫层析试纸,为布鲁氏菌病的现场快速诊断提供一种新方法。本研究首先是制备多克隆抗体。为获得更高滴度和亲和力的抗体,选择了3种不同的免疫方案:即布鲁氏菌全菌蛋白免疫、灭活全菌免疫和全菌免疫。三组分别免疫新西兰大白兔,第三次免疫后抗体效价始终不理想,然后直接用布鲁氏菌全菌以静脉注射的方法进行第四和第五次免疫。通过耳静脉采血,分离血清,用ELISA方法监测抗体水平有明显提高,进而筛选出效价高的两组抗体,纯化后备用。依据上转发光技术的特点,通过对UPT试纸条固相材料筛选（样品垫、结合垫、吸水垫、粘性衬垫厚度和材质及分析膜孔径大小和材质）、固相材料处理、固相材料层压成型、试纸条剪切成型、试纸条外壳设计和液相材料（UCP-SPA结合物、样品垫封闭液、检测带试剂、指控带试剂）的选择,组装成试纸条的雏形。进而对其结合垫与分析膜上的反应体系进行调试和优化,开发出适用于布鲁氏菌检测的条件,并对UPT试纸条的灵敏度,特异性,兼容性,稳定性、重复性等方面进行评价。最后,通过对环境和动物模拟标本的检测,对研制的检测试纸进行了评价。通过对抗体滴度的监测和分析,筛选得到了效价较高的灭活菌免疫兔血清（效价1:32000）和活菌免疫兔血清（效价1:64000）,血清纯化后用于试纸条的研制。在前期的研究中,对UPT试纸条固相材料筛选、固相材料处理、固相材料层压成型、试纸条剪切成型、试纸条外壳设计和液相材料（UCP-SPA结合物、样品垫封闭液、检测带试剂、指控带试剂）等进行了摸索和比较,确定了优化的方案,因此,在本研究中采用了前期已确定好的方案进行试纸条的制作与成形:试纸条的材料选择中结合垫选用玻璃纤维,其有较好的UCP结合物解离状态;分析膜选用硝酸纤维素,加入一定量的表面活性剂而转变为亲水性,其可通过疏水作用力、氢键结合力和静电引力产生极强的吸附,具有广泛的孔径范围以及均一的材质特性;为了保证样品垫封闭液多重功效的充分发挥,选用具有较大床体积及较低液体滞留量的厚（0.70mm）玻璃纤维素膜作为样品垫。吸水垫选用结构较为致密、具有较高液体滞留量的纤维素膜。为了使得整个设计更为人性化,将可对样品液体基质发生颜色响应的5.5-9.0的精密pH试纸固定于吸水垫上作为终点指示带。检测结束时,终点指示带便由黄色变为绿色,给出极为明显的标志通过免疫层析条件的摸索。确定了固相和液相材料以后,对试纸上捕获抗体的浓度和UCP标记的检测抗体的浓度及其配比进行摸索,确定了两者的浓度,其中捕获抗体的A组抗体,浓度为1mg/ml,检测抗体为B组抗体,浓度为1mg/ml。对上样液与封闭液的配比和上样量进行了确定,上样液与封闭液的配比为1:1,上样量为140ul。摸索好检测体系以后,组装了检测试纸条。通过对布鲁氏菌的系列稀释物进行检测,确定了检测方法的阈值,绘制了标准曲线,试纸的检测范围是10⁶～10¹⁰CFU/mL,最低检测限是3.5×10⁴CFU。该试纸检测其它与布鲁氏菌近源和感染方式类似的细菌的检测值均低于阳性阈值,表明该试纸具有很好的特异性。研制的试纸条能够检测在我国最常见的感染人和动物的羊种、牛种和猪种布鲁氏菌,且敏感性处于相同的数量级,表明试纸条能够检测多种布鲁氏菌,具有很好的兼容性。同一批次中的重复检测和不同批次的检测的CV值均低于12%,表明方法具有较好的重复性（其中批间CV值最大为12%,批内CV的均值为6.28%）。将试纸放在37℃,每24h取出测定样品一次（相当于常温下保存1-2个月）,连续测7天,测定的T/C值的CV均值为10.26%,表明研制的试纸具有较好的稳定性。评价了方法的性能以后,组装了UPT免疫层析试纸试剂盒,并通过对模拟样本的检测,对试剂盒进行了评估。将系列稀释的布鲁氏菌按不同比例加入到样品中制备成模拟样本。利用土壤模拟了环境样品、面粉模拟白色粉末、小鼠的脏器模拟新鲜和腐败的样品。用试纸条对模拟样本进行检测,计算不同模拟样本的敏感性。根据阴性和阳性样本的T/C阈值,试剂盒检测模拟样本的敏感性范围为2.8×10⁴～2.52×10⁶CFU。用不同量的布鲁氏菌感染小鼠,取小鼠的脾脏和肝脏,处理后用试纸条进行检测,其中脾脏的检测的敏感性为2.52×10⁶CFU,而肝脏中的细菌因数量太少无法检测到。本研究建立了布鲁氏菌抗原的UPT快速定量检测方法,并研制了试纸条试剂盒,研制的试纸具有较好的特异性、稳定性和重复性,能够检测到环境样本和动物组织模拟样本中的布鲁氏菌。整个检测过程,从样品处理到数据分析,能够在30分钟内完成,从而实现了布鲁氏菌的现场快速检测,为布鲁氏菌的现场快速检测提供了一种新的方法。