背景与目的：E2Fs转录因子家族在细胞周期调控和凋亡反应中发挥着重要作用。作为这一家族中最重要的成员之一，E2F-1一直以来被人们称为“双刃剑”，即有着两种不同的作用：一种是表现在致癌性方面，可以促进细胞周期的进程，引起细胞增殖；另一种是表现在抑癌性方面可以诱导细胞凋亡，抑制肿瘤形成。E2F-1基因敲除的小鼠可以引起一系列肿瘤的发生，而且E2F-1基因功能丧失的小鼠显示出在诱导凋亡反应中的缺陷，这些事实都表明了E2F-1是一种肿瘤抑制因子并且在诱导组织中细胞的凋亡反应过程中发挥着必不可少的作用。然而，E2F-1是如何介导引起细胞死亡进而抑制肿瘤的机制还远不为人们所知，需要进一步的研究探索。由于肿瘤治疗中最主要的目的就是杀死肿瘤细胞，如果我们能够及时发现E2F-1在诱导肿瘤细胞凋亡反应中的机制，鉴定出它下游关键的转录调控靶分子，那么对于肿瘤的治疗来说将有着重要的意义。在这项研究中，我们发现一种双特异性磷酸酶PAC1，它参与到E2F-1介导的肿瘤细胞凋亡反应中，是受E2F-1直接调控的转录靶分子，在引起肿瘤细胞死亡的过程中发挥重要的作用。这种PACl分子，是一种丝氨酸/苏氨酸双特异性磷酸酶，可被外界生长或刺激信号诱导，并特异性地抑制有丝分裂原激活蛋白激酶MAPKs的活化，后者对于细胞周期的运行和基因表达具有重要调控作用。所以，研究PAC1在E2F-1介导的细胞凋亡反应中的作用及分子机制具有十分重要的意义。本研究的目的就是探讨转录因子E2F-1与其基因调控靶分子PAC1之间的相互关系，鉴定PAC1在E2F-1介导的凋亡通路中的作用，进而阐明E2F-1诱导肿瘤细胞凋亡抑制肿瘤生长的分子机制，为肿瘤的基因治疗和化学治疗提供理论基础和实验依据。 方法：1．利用脂质体法转染质粒进入细胞，筛选稳定表达E2F-1的细胞克隆，通过Northern blotting法和Western blotting法鉴定阳性细胞克隆中E2F-1的表达水平以及相应PACl的表达水平；应用荧光素酶法检测E2F-1蛋白对PAC1启动子序列的转录激活水平，并借助体内Chromatin IP法和体外EMSA法分析E2F-1转录因子与PAC1启动子之间的特异性结合作用。2-分别应用Western blotting法，台盼蓝染色法和TUNEL凋亡检测法，鉴定高表达E2F-1的细胞经药物4-羟苯基维胺脂(4-HPR)处理后其ERK1/2 MAPK激酶的水平变化，细胞的生存率变化和凋亡出现的情况；建立高表达PAC1的稳定细胞克隆并检测PAC1本身对ERK1/2 MAPK激酶磷酸化水平的影响和对细胞生长的抑制现象；通过小干扰RNA技术构建表达PAC1-siRNA的稳定细胞株，进一步检测PAC1在E2F-1介导的肿瘤细胞凋亡反应中的作用。3．利用脂体瞬时转染法构建细胞 Saos-2/siE2F1和Saos-2/siPAC1，应用Wrestern blotting法比较细胞中经4-HPR处理前后E2F-1和PAC1的表达水平以及ERK1/2的磷酸化水平，并用台盼蓝染色法检测细胞在不同剂量的4-HPR处理下存活率的改变规律；在Saos-2细胞系统中，用Western blotting法检测E2F-1下游相关靶分子，包括p73、Apaf-1、 caspase-9和caspase-3的蛋白变化情况；选择人成纤维细胞株NHF3作为研究对象，通过检测细胞在不同剂量或不同时间的4-HPR处理下E2F．1、PAC1和p-ERK1/2的表达及细胞存活率的改变，探讨药物4-HPR对正常细胞的作用；应用其他几种临床常用的抗肿瘤药物，如依托泊苷Etoposide(50μM)、5-氟尿嘧啶5-FU(30μM)、阿霉素Doxorubicin(1.7μM)和吲哚美辛Indomethacin(500μM)，与药物4-HPR进行平行比较，检测高表达E2F-和PAC1的细胞在不同药物处理下的存活率。 结果：1.在细胞MB435/E2F1-C2和MB435/E2F1-C3中有高水平的E2F-1转录和表达，同时PACI的mRNA水平和蛋白水平也随着E2F-1相应升高；荧光素酶法结果显示，与对照组的空白质粒相比，共转染E2F-1的表达质粒和含正常PAC1启动序列的荧光素酶报告质粒可以使检测到的荧光素酶活性增加约15倍，E2F-1可以通过激活PAC1的启动子实现对PAC1的转录表达调控；体内Chromatin IP法和体外EMSA法的结果证实E2F-1转录因子与PAC1启动子之问有特异性结合作用。2．在抗肿瘤药物4-HPR作用下，高表达E2F-1可以抑制ERK1/2 MAPK激酶的活化并诱导肿瘤细胞发生凋亡；利用高表达。PAC1的细胞进行一系列检测，结果显示PAC1本身也可以通过抑制ERK1/2 MAPK激酶信号通路而诱导肿瘤细胞凋亡；进一步对PAC1-siRNA细胞克隆的检测显示当除去PAC1的作用以后，E2F-1就不能够抑制ERK1/2激酶的活化，而且E2F-1也不能够有效地介导4-HPR作用下的细胞凋亡反应，证明PACI是E2F-1凋亡通路中重要的介导者，在E2F-1诱导的肿瘤细胞凋亡反应中起重要作用。3．对细胞Saos．2/siE2F1和Saos-2/siPAC1的检测结果显示在降低了内源性的E2F-1表达水平或PAC1表达水平后，其对ERK1/2激酶的抑制作用减弱，细胞对药物4-HPR的敏感性降低；检测其它一些与E2F-1凋亡功能相关的靶分子，结果显示4-HPR处理后的Saos-2细胞中，并没有看到这些分子被诱导表达的现象，证实E2F-1/PAC1途径是一条特异性的传递凋亡信号的通路；将药物4-HPR应用在人正常成纤维细胞NHF3中，结果证明正常细胞对该抗肿瘤药物4-HPR并不敏感；应用了其他几种常用的抗肿瘤药物后，结果显示药物Etoposide、 5-Fu和Doxorubicin并没有引起高表达E2F-1和PAC1的细胞出现明显的凋亡，而药物Indomethacin处理后可以引起高表达E2F-1和PAC1的细胞出现明显的凋亡现象，这种表现与使用药物4-HPR后类似。 结论：1．PAC1是E2F-1的直接转录调控靶分子。 2．E2F-1可以通过PAC1抑制ERK1/2激酶的活化并诱导肿瘤细胞发生凋亡。3．E2F-1/PAC1/MAPKs通路是E2F-1介导下的一条特异性的凋亡信号通路，药物4-HPR通过该通路对肿瘤细胞有特异性杀伤作用，对正常细胞的毒副作用较小，具有临床应用价值。