【摘 要】
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干扰素(Interferon, IFN)是脊椎动物病毒防御系统的重要组成部分,主要分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中Ⅲ型干扰素又称λ干扰素(IFN-λ),是2003年发现的一种新型干扰素家族。Ⅲ型
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干扰素(Interferon, IFN)是脊椎动物病毒防御系统的重要组成部分,主要分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中Ⅲ型干扰素又称λ干扰素(IFN-λ),是2003年发现的一种新型干扰素家族。Ⅲ型干扰素不仅具有与Ⅰ型干扰素相似的抗病毒活性,而且具有与Ⅱ型干扰素相似的免疫调节功能。IFN-λ受体分布的特异性,表明IFN-Xλ能够在一些上皮细胞及免疫细胞上发挥相对独立和特异的抗病毒作用。本研究以ChIFN-λ为研究对象,利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统表达重组ChIFN-λ,初步开展了其抗病毒活性研究。本研究以鸡肾组织提取的总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增ChIFN-λ。序列分析表明ChIFN-λ全长561 bp,共编码186个氨基酸,其中前23个氨基酸构成ChIFN-λ,信号肽。亚克隆其成熟蛋白编码基因492 bp,将其克隆入pET-32a,构建原核表达载体pET-32a-ChIFN-λ,转化至大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析证实表达产物为36 KD左右的融合蛋白,并且主要以不溶性包涵体存在。利用高亲和Ni-NTA层析树脂纯化表达产物,将其作为抗原免疫BALB/c小鼠,制备ChIFN-λ的多克隆抗体,ELISA检测血清抗体效价为1：16000。分别将此血清与抗His单克隆抗体作为-抗,通过Western-blot检测ChIFN-的原核表达产物,结果均在36 KD处出现特异性条带。为了使ChIFN-λ能够以分泌形式表达,利用重叠PCR在ChIFN-λ成熟肽序列前引入昆虫细胞可识别的gp67信号肽序列,将其克隆至载体pFastBacTM1中,构建转移载体pFastBac-gp67SP-ChIFN-λ,转化DH10ac感受态细胞,通过特异性位点转座,将ChIFN-λ整合到]Bacmid穿梭质粒中,经过筛选纯化得到穿梭质粒Bacmid-ChIFN-λ;用脂质体介导穿梭质粒转染Sf9细胞,得到重组杆状病毒AcMNPV-ChIFN-λ。间接免疫荧光和Western-blot试验证明带有gp67信号肽的重组ChIFN-λ在昆虫细胞中呈现分泌表达。在昆虫细胞感染96h后,分别收获细胞上清和细胞裂解液,并通过水泡性口炎病毒(VSV)感染鸡胚肾细胞(CEKC)的细胞病变抑制试验测定细胞上清和细胞裂解液的抗病毒效果,结果表明细胞培养上清中的重组蛋白表现出较高的抗病毒活性,上清的抗病毒效价为1.44×106U/mL,昆虫细胞裂解液的抗病毒效价为4.76×105U/mL。以重组ChIFN-λ进行对新城疫病毒(NDV)和禽流感病毒(AIV)的抗病毒活性试验,发现重组ChIFN-λ对NDV和AIV有明显的抑制其致细胞病变作用,在CEK细胞上的抗病毒效果分别为1.82×106U/mL和1.94×106U/mL。综上所述,本研究成功克隆出ChIFN-λ全基因,利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统表达了具有分泌能力的重组ChIFN-λ,表达产物对VSV、AIV和NDV具有显著的抗病毒效果。本研究说明重组ChIFN-λ具有良好的应用前景,为体外大量制备高效廉价的重组ChIFN-λ奠定了基础。
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