FKBPs是亲免素(Immunophilin)家族的一员,目前在大豆、玉米、蓖麻、番茄、葡萄等植物中已经成功分离,并克隆得到它们的FKBP基因。FKBPs可与免疫抑制剂FK506和雷帕霉素特异性地结合从而产生免疫抑制作用。同时,FKBPs具有肽脯氨酰顺反异构酶(PPIase)活性,能够催化蛋白质的折叠、装配和转运,在植株的生长发育过程中扮演着重要的角色。本研究在构建好的蜡梅花cDNA文库中克隆得到一个蜡梅FKBP基因,再对该基因进行分子序列特征分析,原核表达,酶活性测定和转化烟草的分析。本实验的具体结果如下：1、蜡梅亲免素基因的克隆以及分子特征分析在已构建好的蜡梅花cDNA文库及EST分析的基础之上,随机克隆测序得到一个蜡梅FKBP基因,克隆得到的蜡梅CpFKBP cDNA的全长为482bp,最大ORF框为339bp,该基因一共编码了113个氨基酸,预测等电点为8.48,其理论分子量约为12.08KD。在本研究中将其命名为CpFKBP(GenBank登录号：JQ337962)。分子特征分析发现蜡梅FKBP基因编码的蛋白与毛果杨,蒺藜苜蓿等FKBPs氨基酸序列的相似性接近90%,在结构上蜡梅FKBP属于单结构域亲免素。CpFKBP所编码的蛋白.其二级结构主要由58.93%的随机卷曲、28.57%的延伸链和12.5%的α螺旋构成,其编码的蛋白不存在跨膜结构,无信号肽,且具有良好的疏水性,有4个磷酸化位点。2.CDFKBP原核表达载体构建、表达体系优化及PPIase酶活分析在CpFKBP两端加上BamHI和SacI酶切位点,通过克隆载体pMD19-T将CpFKBP连接到载体pET-32a(+)上,再转化至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)进行诱导表达。从诱导温度、诱导表达时间和IPTG终浓度三个方面系统优化表达体系。经优化重组蛋白在低温16℃条件下诱导24小时可达到最高表达量。PPIase活性分析显示重组蛋白具有较高的异构酶活性。3.CpFKBP基因植物表达载体构建及对烟草转化CpFKBP两端加上BAmHI和Sac I酶切位点,再与pMD19-T连接,分别用BamHI和SacI双酶切pMD19-T/CpFKBP和表达载体pCAMBIA2301g,将回收目的片段连接,获得重组质粒pCAMBIA2301g-CpFKBP。采用电转法,将重组质粒转化至农杆菌LBA4404。再采用叶盘法转化烟草,获得具有Km+抗性的烟草植株,通过GUS检测和PCR检测,最终获得20株转基因烟草单株系。