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牦牛作为青藏高原地区重要经济物种资源,生存环境长期受到高寒环境的严峻挑战,通过辅助繁殖技术可以改善并促进青藏高原地区畜牧业的发展。为了提高牦牛体外胚胎发育质量,本研究探索不同生长因子调控牦牛体外胚胎代谢及凋亡机制,通过改善成熟卵母细胞玻璃化冷冻后的培养方法,减少玻璃化冷冻对体外胚胎发育所造成的伤害,本研究进行了以下实验:(1)收集和培养牦牛成熟COCs,采用CT法对其进行玻璃化冷冻,成熟COCs经冷冻-解冻后经过IVF,在IVF胚胎培养过程中加入不同浓度的IGFI,分析不同处理组体外受精胚胎发育能力,统计胚胎卵裂率和囊胚率,采用间接免疫荧光染色的方法统计囊胚中ICM细胞数、细胞总数及ICM细胞所占比例,运用Real-time PCR、间接免疫荧光技术,检测不同处理组AQP3、Bax、Bcl-2基因表达水平与AQP3蛋白表达水平。研究发现玻璃化冷冻可显著降低牦牛囊胚中AQP3基因和蛋白表达水平(P<0.05),100 ng/m L IGF-I处理组可抵消玻璃化冷冻对AQP3表达所产生的影响,其表达量与无冷冻无IGF-I添加对照组差异不显著(P>0.05);同时经玻璃化冷冻后100 ng/mL IGF-I处理组相对于冷冻后0 ng/m L IGF-I处理组其Bax基因表达量下调,Bcl-2基因表达量上调,与对照组差异不显著(P>0.05)。无玻璃化冷冻对照组和冷冻后100 ng/m L IGF-I处理组中平均每个牦牛囊胚中的细胞总数无显著性差异(P>0.05),且均高于其他处理组,5组ICM所占百分比无显著性差异(P>0.05)。100 ng/m L IGF-I处理组与对照组的卵裂率与囊胚率无显著性差异(P>0.05)。这两组胚胎的卵裂率和囊胚率显著高于0 ng/mL IGF-I,50 ng/m L IGF-I和200 ng/m L IGF-I处理组(P<0.05)。结果表明100 ng/m L浓度IGF-I是牦牛COCs解冻后恢复发育的最佳浓度,调控囊胚中AQP3表达量,其表达量上升可能改善细胞膜的渗透性及囊胚腔的形成能力;同时调控凋亡相关基因Bax、Bcl-2,缓解冷冻后对胚胎发育所造成的影响。(2)收集和培养牦牛COCs,成熟后进行IVF培养,牦牛未成熟COCs随机分为4组:IVF胚胎培养时分别添加0、50、100、200 ng/m L IGF-I。0 ng/m L IGF-I作为实验对照组。采用Real-time PCR、间接免疫荧光技术检测4组囊胚中Glut-1,Bax,Bcl-2基因相对表达量以及统计4组胚胎卵裂率、囊胚率以及平均每个囊胚中细胞总数和ICM数目所占比例,以此评估IGF-I对牦牛体外胚胎发育的调控。结果显示:Bax基因在100 ng/mL IGF-I处理组中表达量最低,在0 ng/m L和50 ng/m L处理组中表达量最高且差异不显著(P>0.05),在200ng/mL IGF-I处理组的表达量略高于100 ng/mL处理组。而Bcl-2基因在100ng/mL IGF-I处理组的相对表达量最高,50 ng/mL和200 ng/m L处理组Bcl-2基因相对表达量高于对照组,且二者差异不显著(P>0.05)。Glut-1基因的相对表达量在100 ng/mL IGF-I和200 ng/m L IGF-I处理组中显著高于对照组(P<0.05),Glut-1表达量的升高可有效为牦牛体外胚胎发育提供能量支持,50ng/mL IGF-I处理组Glut-1基因的表达量显著高于对照组,但表达量显著低于上两组(P<0.05),因此IGF-I处理胚胎可显著提高胚胎中Glut-1基因表达量。100 ng/mL IGF-I处理组卵裂率及囊胚率显著高于其余3组,囊胚中细胞总量及ICM所占百分比也明显提升。结果表明牦牛卵母细胞成熟和胚胎发育过程中IGF-I作为重要的自分泌或旁分泌因子,调控Bax、Bcl-2、Glut-1等凋亡与代谢相关基因的表达提高牦牛体外受精胚胎的发育能力。(3)收集和培养牦牛COCs,成熟后进行PA培养,牦牛未成熟COCs随机分为4组:未成熟COCs和PA胚胎培养时分别添加0、50、100、200 ng/m L EGF。0 ng/m L EGF作为实验对照组。采用Real-time PCR、间接免疫荧光技术检测4组囊胚中Cx43和HSP90基因相对表达量。根据孤雌激活时第一极体排出数量统计4组卵母细胞成熟率,并统计后续胚胎发育时卵裂率及囊胚率。结果显示:EGF处理COCs可显著提高COCs成熟率及PA胚胎卵裂率囊胚率及发育质量(P<0.01),最佳的作用浓度为100 ng/mL。EGF也可显著提高牦牛囊胚中Cx43和HSP90基因的表达,EGF对Cx43和HSP90基因的最佳作用浓度分别为50 ng/m L和100 ng/m L,100 ng/m L EGF也可显著提高Cx43表达量。综合分析结果表明:EGF可通过调控HSP90和Cx43等凋亡和发育相关基因的表达显著提高牦牛孤雌胚胎发育能力。(4)收集和培养牦牛COCs,成熟后进行IVF培养,随机进行分组,生长因子LIF 200 ng/mL剂量作用于牦牛COCs及IVF胚胎,0 ng/m L LIF作为对照处理组。采用Real-time PCR检测牦牛未成熟COCs、成熟COCs、2细胞胚胎、8细胞胚胎、桑椹胚、囊胚中STAT3基因表达水平;采用间接免疫荧光染色方法观察STAT3蛋白在COCs及胚胎各个阶段表达,并统计不同组胚胎在各个阶段发育率。结果显示:LIF可显著提高牦牛IVF胚胎的囊胚中STAT3基因表达(P<0.01),对牦牛未成熟COCs、成熟COCs、2细胞胚胎、8细胞胚胎及桑椹胚发育阶段STAT3表达水平无显著作用。LIF对牦牛IVF胚胎前期发育率无显著影响,但可显著提高牦牛桑椹胚到囊胚阶段发育率(P<0.01)。此外,STAT3在成熟COCs和囊胚中的表达显著高于未成熟COCs和前期发育胚胎。结果表明:生长因子LIF通过调控牦牛胚胎中转录相关基因STAT3,同时显著提高牦牛胚胎囊胚率。本研究为促进牦牛胚胎体外发育提供一定的理论依据。本研究从牦牛卵母细胞体外成熟、体外胚胎发育、卵母细胞玻璃化冷冻等生物学过程研究了IGF、EGF及LIF对牦牛IVF及PA胚胎发育的作用机制:1.生长因子IGF-I在牦牛成熟卵母细胞CT玻璃化冷冻及解冻后对牦牛胚胎发育产生一定影响,通过解冻后调控凋亡相关基因Bax、Bcl-2以及AQP3基因和蛋白,以此提高牦牛IVF胚胎发育能力,减少玻璃化冷冻对牦牛胚胎发育的伤害。2.生长因子IGF-I调控牦牛体外IVF胚胎糖代谢相关基因Glut-1的表达,同时抑制胚胎细胞凋亡。3.生长因子EGF调控牦牛PA胚胎Cx43表达水平,提高胚胎相邻细胞间连接与交流,同时调控HSP90基因,以适应体外培养应激环境。4.生长因子LIF通过调控STAT3基因调节牦牛IVF胚胎发育过程中转录相关因子,从而提高胚胎发育能力。