研究背景湿热证是由外环境、机体的免疫状态、病原微生物共同作用的结果,具有时间性、地域性;其发病机制是机体在热暴露和潮湿环境下,因“湿”“热”病邪共患,导致脾胃功能失调,再受到细菌、病毒等生物因子侵袭,随之发生一系列生理病理上的改变。流感病毒是ssRNA分节段病毒,病毒的变异性大、传染性强、易造成大流行,多年来一直威胁人类的健康。岭南地区高温多雨,是许多细菌和病毒的温床,有研究发现,呼吸道病毒感染是岭南地区临床常见病,并且是以流感病毒、副流感病毒感染为主;所以在岭南地区研究流感病毒引起的湿热证意义重大。目前在市面上西医抗病毒感染的主要有疫苗和抗病毒制剂,但疫苗的制作存在滞后性,面对病毒的变异显得防不胜防;抗病毒的制剂也只有在早期才能达到预期效果;而中药在治疗此类疾病有独特优势。临床上发现,蒿芩清胆汤在治疗流感病毒所引起的发热疗效显著;但其作用靶点和机理尚未明确。因此,探讨蒿芩清胆汤对流感病毒引起的湿热证的治疗作用,并寻找可能的信号通路,具有其独特意义,为该药治疗此类疾病打下理论基础。目的建立符合临床症状的流感病毒性肺炎湿热证模型,并用蒿芩清胆汤进行治疗,观察蒿芩清胆汤的作用靶点,并探讨可能的信号转导通路,为药物在疾病治疗中奠定理论基础。方法实验分为两个部分。第一部分:流感病毒肺炎湿热证模型的建立。将小鼠随机分为正常组、病毒组（单纯病毒感染造模）、复合模型组（肥甘饮食+湿热环境+病毒感染）。由造模日起,常温饲养9d,其中对照组和病毒组用普通饲料喂养,复合模型组用高脂饲料（普通饲料、蜂蜜、猪油以20:2:3的比例配制;由广东省医学实验动物中心制备）第10d时复合模型组及病毒组小鼠滴鼻感染甲1型流感病毒,攻毒量为30LD₅₀,对照组则滴鼻等量的无菌LB液体培养基。24h后,将复合模型组置于人工气候舱进行热暴露3h;温度（32±0.5）℃,湿度（55～60）%.隔日进行热暴露一次,共3次。由造模之日起,于1d、7d、10d、14d的9:00AM称各组小鼠体重,并检测其肛温,于5d、8d、10d测血脂。造模完成后采用RT-PCR检测小鼠肺病毒含量并观察各组小鼠肺组织的病理改变。对各组小鼠进行肛温、血脂、肺病变程度等方面的比较。第二部份:蒿芩清胆汤对流感病毒性肺炎湿热证的作用机理及其机制的探讨。将小鼠随机分为正常组、病毒组（单纯病毒感染）、复合模型组（高脂饮食+湿热环境+病毒感染）、阳性药物组（模型组+病毒唑）、蒿芩清胆汤组（模型组+蒿芩清胆汤）。造模方法同实验第一部分,两个药物组由病毒感染后2小时内给药.每天给药两次。造模结束后,取各组小鼠肺组织,分别称量小鼠的体重和肺重,计算各组小鼠肺指数及肺指数抑制率;用免疫组织化学法测其肺组织NF-κB的阳性表达;提取各组小鼠的腹腔巨噬细胞,用RT-PCR的方法检测TLR2及NF-κB mRNA的表达;采用双抗体夹心ELISA法测定血清中IL-4、IFN-γ的浓度,并计算IFN-γ/IL-4比值来了解机体Th1/Th2类细胞的平衡状态。结果第一部分:流感病毒肺炎湿热证模型的建立。1.一般状态观察常温环境饲养,复合模型组小鼠体重增长快,皮毛油亮光泽;进入热环境后,先有一段躁动期,活动量、饮水量增加,呼吸急促,继而进入安静状态,活动减少,散在静卧,呼吸仍旧急促。回到室温,约1h恢复常态。病毒攻击后24h,病毒组小鼠开始活动减少,进食,饮水量明显减少,复合模型组小鼠症状不明显。48h后,复合模型组小鼠开始出现上述症状,病毒组症状加重,并有呼吸急促,扎堆蜷缩,反应迟钝等症状,体毛开始脱落。96h后,病毒组小鼠爪甲紫绀,体毛稀疏,体重明显减轻。复合模型组小鼠也出现类似症状,但出现时间较病毒组小鼠晚,症状也比单纯感染病毒的小鼠轻。2.各组小鼠体重、肛温及血脂的变化①各组小鼠体重的变化:造模前,正常组、病毒组、复合模型组数据分别是:（12.50±0.64）g,（12.62±0.61）g,（12.67±0.69）g;7d时,正常组、病毒组、复合模型组数据分别是:（16.65±0.67）g,（17.88±0.91）g,（18.80±0.7）g;10d时,正常组、病毒组、复合模型组数据分别是:（18.8±0.75）g,（18.75±1.24）g,（22.7±1.26）g;复合模型组体重和正常组相比,已显著升高（P＜0.05）。②肛温的变化:正常组、病毒组、复合模型组数据如下:1d时,（34.7±0.3）℃、（34.9±0.4）℃、（34.6±0.5）℃;7d时,（35.6+0.4）℃、（35.±0.4）℃、（36.7±0.3）℃;14d时,（35.8±0.2）℃、（35.8±0.2）℃、（36.8±0.3）℃;第7d和14d时,复合模型组高于正常组和病毒组,有统计学意义（P＜0.05）。③血脂的变化:模型组和正常组的TG分别是:5d时,（6.74±1.03）mmol/L,（5.74±1.79）mmol/L;8d时,（6.74±1.03）mmol/L,（5.74±1.79）mmol/L;10d时,（6.74±1.03）mmol/L,（5.74±1.79）mmol/L;从第5d起,两组数据已有显著差异,有统计学意义（P＜0.01）。3.肺指数和肺病变程度①各组小鼠肺指数:正常组、病毒组、模型组分别为（0.79±0.11）%、（1.93±0.38）%、（1.41±0.26）%,病毒组、模型组和正常组相比,均有统计学意义（P＜0.01）。②肺病变程度（肉眼判定）:均有改变,和正常组相比有差异。第二部分蒿芩清胆汤对流感病毒性肺炎湿热证的作用机理及其机制的探讨1.药物对模型小鼠肺指数的影响各组小鼠肺指数:正常组、病毒组、复合模型组、阳性药物组和蒿芩清胆汤组分别为（0.79±0.11）%、（1.93±0.38%）、（1.41±0.26）%、（1.10±0.26）%、（1.02±0.16）%;阳性药物组和蒿芩清胆汤组小鼠的肺指数和复合模型组相比均有所减低,有统计学意义（P＜0.05）。2.各组小鼠肺组织NF-κB的表达图片分析及平均光密度值①结果显示,病毒感染后,小鼠肺泡上皮细胞可见NF-κB的活化和阳性表达。阳性细胞主要为浸润于病灶中的炎性细胞及周围的肺泡上皮细胞,活化的NF-κB（p65）表达于细胞核中,呈棕黄色颗粒。②各组小鼠NF-κB平均光密度值为:0.208±0.005、0.321±0.033、0.305±0.029、0.254±0.041和0.247±0.041;蒿芩清胆汤组、阳性药物组和复合模型组之间相比差异相显著（p＜0.05）。3.TLR2-mRNA的表达的变化RT-PCR的结果显示,正常组、病毒组、复合模型组、阳性药物组和蒿芩清胆汤组TLR2-mRNA的表达分别是0.145±0.017、0.991±0.149、0.903±0.124、0.257±0.032和0.413±0.031;蒿芩清胆汤组、阳性药物组比复合模型组的小鼠低,均有统计学意义（P＜0.01）。4.腹腔巨噬细胞NF-κB-mRNA表达的变化正常组、病毒组、复合模型组、阳性药物组和蒿芩清胆汤组NF-κB-mRNA的表达分别是0.075±0.015、0.379±0.019、0.291±0.012、0.169±0.026和0.175±0.033;阳性药物组、蒿芩清胆汤组与复合模型组相比均有所减低（P＜0.01）。5.血清中细胞因子含量的变化①IFN-γ的变化:正常组、病毒组、复合模型组、阳性药物组和蒿芩清胆汤组小鼠血清中IFN-γ含量分别为（7434.06±323.27）pg/ml、（8679.77±198.70）pg/ml、（8068.78±113.8）pg/ml、（7454.66±301.30）pg/ml和（7484.56±229.85）pg/ml;蒿芩清胆汤组和阳性药物组血清中IFN-γ含量比复合模型组减低,有统计学意义（P＜0.05）。②各组小鼠IL-4含量分别为（3701.74±256.00）pg/ml、（3569.64±161.35）pg/ml、（3530.88±334.63）pg/ml、（3481.84±282.25）pg/ml和（3618.00±262.16）pg/ml;无显著差异。③Th1/Th2类细胞的比值（即IFN-γ/IL-4）分别为:2.02±0.19、2.38±0.10、2.36±0.14、2.22±0.17和2.07±0.15;与复合模型组相比,蒿芩清胆汤组和阳性药物组均减低趋势。结论1.在遵循“外湿引动内湿”的前提下,实验尝试选用流感病毒作为生物感染因子用“环境+高脂饮食+生物感染因子”复制湿热证模型,该模型从发病条件、体征,病变程度上不仅符合湿热证的症状,还具有操作简单,重复性好等优点,有较高的应用价值。此研究不仅扩大了湿热证的内涵,对既往模型的研究作了补充,更体现出其明显的创新性,从另一方面诠释了湿热证;此外,还为进一步的研究奠定模型基础。2.流感病毒性肺炎湿热证经药物治疗后发现:蒿芩清胆汤能降低模型小鼠的肺指数,保护肺组织,减少其免疫损伤;在体内实验中证实了蒿芩清胆汤治疗流感病毒性肺炎湿热证的有效性。3.流感病毒入侵机体时,能激活细胞膜上的TLR2并使其高表达;蒿芩清胆汤能下调细胞膜表面的TLR2 mRNA的表达,通过抑制信号转导,达到减少其后续反应的目的。4.流感病毒性肺炎湿热证的小鼠肺上皮细胞的NF-κB活性增强、腹腔巨噬细胞内NF-κB mRNA转录水平增高。蒿芩清胆汤能下调NF-κB mRNA的表达,和TLR2 mRNA的表达趋势一致。5.流感病毒性肺炎湿热证小鼠血清中IFN-γ显著升高,而IL-4的升高并不明显,Th1/Th2向Th1漂移,细胞免疫占优势,造成肺组织损伤,加重病情。蒿芩清胆汤能降低血清中IFN-γ含量,使Th1/Th2类细胞比值向平衡方向回归。6.蒿芩清胆汤是治疗流感病毒性肺炎湿热证的有效药物;它通过下调信号转导通路上的关键分子TLR2和NF-κB mRNA的表达来调节细胞因子的分泌,发挥生物学效应。其可能的机制如下:蒿芩清胆汤通过下调细胞膜表面TLR2mRNA的表达来抑制NF-κB的活化,调节体内细胞因子的分泌,降低血清中细胞因子IFN-γ的含量,改善Th1/Th2类细胞失衡状态,减少炎症因子造成的免疫损伤,从而起到保护肺组织的作用。