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赭曲霉毒素（Ochratoxin）是由青霉菌属（Penicillium）和曲霉菌属的霉菌产生的有毒的次级代谢产物,在全球范围内严重威胁着农产品的安全。其中赭曲霉毒素A（ochratoxin A,OTA）因毒性最大、农作物污染程度最深、分布最广、与人类健康关系最密切而广为人知。传统的检测手段,如基于仪器建立的高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）、液相质谱联用法（Liquid Chromatography-electrospray Mass Spectrometry,LC-MS）因存在仪器成本高、操作流程繁琐、需专业受训人员等而限制其推广应用。传统的酶联免疫吸附测定法（Enzyme–linked Immunosorbent Assay,ELISA）是经典的检测方法,具有操作简便,成本低廉,能满足高通量筛查的优点,但也因检测灵敏度低,无法实现对痕量物质定量检测;且其显色物质四甲基联苯胺（tetramethylbenzidine,TMB）,因其显色单一,裸眼辨识度差,无法实现定性检测。因此,能实现高灵敏和裸眼判读的新型ELISA检测方法,成为当下研究的热点。色彩分辨检测的光学生物传感方法因使用便捷、成本低廉,可实现裸眼判读的优势,成为一种潜在的解决手段而备受关注。本研究以OTA为检测对象,以特异性单克隆抗体与竞争酶标记抗原为生物识别元件,分别建立基于脲酶介导的pH响应及金纳米花局域等离子共振比色定性及定量ELISA方法。（1）基于脲酶介导的pH响应ELISA的基本原理如下:该方法以传统直接竞争ELISA为基础,以脲酶取代辣根过氧化物酶（Horse Radish Peroxidase,HRP）,以溴甲酚紫（bromcresol purple,BCP）代替TMB进行显色。竞争结合的酶表抗原催化尿素产生氨气,引发溶液pH值发生改变。BCP作为一种对pH极度敏感的酸碱指示剂,其溶液颜色的变化与待测物的浓度具有量效关系,因此通过监控BCP颜色及吸光值变化可实现待测物定性及定量检测。该方法具体研究内容如下:通过活泼酯法制备Urease@OTA偶联物,Urease与OTA的摩尔比为1:5.73;通过棋盘滴定法确定抗OTA单克隆抗体（anti-OTA mAb）最佳包被浓度为0.085μg/mL,Urease@OTA最佳使用浓度为1.94μg/mL;进一步优化影响免疫学及显色反应的相关条件,其中免疫学反应缓冲液包含有0.128 M的NaCl及10%的甲醇（pH=5.96）,脲酶催化尿素温度为37℃,催化时间为30 min,尿素浓度为0.1 M。在最适的反应条件下,该方法定量检测OTA的线性范围12.5 pg/mL100pg/mL,标准曲线方程为:y=-0.3391ln（x）+1.7688（R2=0.9895）。该方法检测OTA的50%抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)为31.4 pg/mL,裸眼判读灵敏度为50 pg/mL,较常规ELISA定量和定性检测灵敏度分别提高11.3和12.5倍。实际样本OTA加标回收实验显示:批内回收率为83.7%108.8%,变异系数为3.71%13.5%;批间检测回收率为86.2%111%,批间变异系数为3.71%13.5%。进一步对70个随机添加OTA的玉米样本进行裸眼定量检测,结果显示准确率达到95.71%,表明pH响应ELISA方法对于实际样本检测具有可行性。（2）基于脲酶介导金纳米花局域等离子共振ELISA（pELISA）基本原理如下:脲酶水解尿素产生氨,硝酸银在氨与葡萄糖存在下,被还原成银纳米粒子,沉积在金纳米花（AuNFs）表面,形成Au@Ag的核壳结构。随着,银粒子沉积厚度的不同,导致其等离子共振峰发生蓝移且溶液颜色发生由蓝色到黄色的转变,因此通过监控AuNFs等离子共振峰及颜色变化可实现待测物定量及定性检测。pELISA具体研究内容:通过棋盘滴定法确定anti-OTA mAb最佳包被浓度为0.16μg/mL,Urease@OTA最佳使用浓度为7.55μg/mL;进一步优化了影响AuNFs金属化的相关条件,其中脲酶催化底物时间为40 min,尿素浓度为100 mM,AgNO3浓度为10 mM,葡萄糖浓度为200 mM。在最佳条件下,建立了针对OTA的定量检测标准曲线:y=-0.0565ln（x）+1.0901（r2=0.9975）,定量线性范围为5.0pg/mL640 pg/mL,裸眼检测限为40 pg/mL,最低检测灵敏度为8.205 pg/mL,灵敏度相较于常规ELISA分别提高了15.6和14.3倍。与其他常见真菌毒素的交叉反应实验结果显示该pELISA方法具有较好的特异性。对四种实际样本包括:面粉、玉米、白葡萄酒、大米进行加标实验,结果显示四种样品加标平均回收率为81.5%106%（变异系数为6.13%18.7%）;该结果进一步与超高液相色谱结果进行比较显示两种方法具有较好的一致性,对72个实际样本进行检测分析,无假阳性及假阴性结果出现。总之,本论文建立了两种基于脲酶介导的高灵敏检测OTA的比色ELISA新方法,该方法不仅可实现OTA定量检测,同是亦可实现裸眼检测。