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第一章阿帕替尼联合放化疗治疗复发、晚期宫颈癌的疗效及安全性的临床研究目的:阿帕替尼(Apatinib),是一种酪氨酸激酶活性的抑制剂(TKI),它可以高度选择性的抑制血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2),在多种实体肿瘤治疗中均表现出良好的安全性和积极的治疗效果。这部分的临床研究目的是评价阿帕替尼(Apatinib)联合同步放化疗治疗复发、晚期宫颈癌的临床疗效和安全性。方法:对2016年7月至2018年5月就诊于山东省肿瘤防治研究院妇瘤科的 59 例IVB期(International Federation of Gynecology and Obstetrics Staging,FIGO分期)初次治疗及治疗后首次复发的宫颈癌患者开展此项随机对照试验。所有符合入选标准的患者(n=59)按1:1被随机分成了两个组,即阿帕替尼组(n=30)和对照组(n=29)。阿帕替尼组首次复发宫颈癌患者采用阿帕替尼联合卡铂-紫杉醇一线化疗方案。阿帕替尼组IVB期初治宫颈癌患者接受阿帕替尼联合卡铂(Carboplatin)-紫杉醇(Paclitaxel)化疗同步后装放疗(concurrent chemo-brachytherapy,CCBT)。对照组内首次复发的患者,给予卡铂(Carboplatin)-紫杉醇(Paclitaxel)静脉联合化疗,对照组内的IVB期初治患者,给予卡铂-紫杉醇化疗同步后装放疗。结果:59例入组患者中,7例因多种因素于疗效评价前即终止临床试验。最终纳入分析的共52例(阿帕替尼组28例,对照组24例),两组患者的年龄、ECOG评分、体重指数、转移部位、转移数目、分化程度、肿瘤病理类型、手术史和治疗方式等基本特征相似。此临床试验中,受试者的中位随访的时间(PFS)是14.0个月,截止到随访截止日(2019-4-30),已有27例受试者死亡,占总人数的51.9%。疗效评价显示,阿帕替尼组内,中位总无进展生存期(progression-free-survival,PFS)较对照组明显延长(10.1 月 vs 6.4 月,P<0.01;HR,0.44,P<0.01)。分层分析显示,首次复发宫颈癌患者,阿帕替尼联合化疗组患者的中位PFS,相比于单纯化疗组明显升高(10.1月vs 6.4月,P<0.01)。IVB期初治宫颈癌患者,阿帕替尼联合同步放化疗(CCBT)的患者比对照组只是接受了 CCBT的患者,她们的的中位PFS显著增加(10.3月vs 6.1月,P<0.01)。Apatinib组受试者的客观缓解率(ORR,objective response rate),明显的比对照组要高(64.3%vs 33.3%,P<0.05),差异有显著性。多因素分析结果可以看出,骨转移(P<0.001)、腺癌(P<0.05)和阿帕替尼联合治疗(P<0.01)是疾病独立的预后因素,骨转移和病理类型为腺癌预后较差,可导致PFS缩短,而阿帕替尼联合治疗作为保护因素,延长了患者的PFS。安全性评估分析显示,阿帕替尼组的蛋白尿、粘膜炎、手足综合征和高血压等并发症,各级别的发生率均要明显高于对照组(P<0.05),当阿帕替尼减量或给予受试者对症治疗时,严重的副反应可得到充分缓解。阿帕替尼未明显加重放化疗的其他副作用。结论:阿帕替尼联合同步放化疗或联合单纯化疗对复发、晚期宫颈癌患者具有良好的疗效,可延长PFS,提高ORR,且毒副作用可控。阿帕替尼与放化疗具有协同抗肿瘤作用。第二章阿帕替尼联合放疗对人宫颈癌SiHa及HeLa细胞裸鼠移植瘤抑制作用的实验研究研究目的:放射治疗在宫颈癌的治疗过程中,有其非常重要的地位,部分患者放疗不敏感导致放疗效果较差。阿帕替尼(Apatinib)作为高度选择性VEGFR2抑制剂,因其抗血管生成机制使其成为潜在的放疗增敏剂。但是阿帕替尼联合放疗在宫颈癌治疗领域的实验研究少见报道,且机制不清。在本章节中,我们通过建立人宫颈癌SiHa及HeLa细胞裸鼠移植瘤模型,进一步验证阿帕替尼在体内实验,即宫颈癌裸鼠移植瘤模型中的抗肿瘤作用及其对肿瘤细胞放疗敏感性的影响,并对其可能的分子机制进行初步探索。研究方法:这部分实验选取的人宫颈癌细胞系是SiHa及HeLa细胞系,以其为研究对象,建立人宫颈癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型,并分组观察疗效。每种模型具体分为4组:①对照组;②Apatinib组;③放疗组;④Apatinib+放疗组。通过绘制肿瘤生长曲线观察对比各组的疗效差异。通过对荷瘤裸鼠进行血细胞分析及心、肝、肾组织的HE染色观察药物的安全性及毒副作用。通过免疫组化法检测CD31蛋白的表达情况,测算微血管密度(MVD)的改变验证Apatinib在裸鼠移植瘤模型中的抗血管生成作用,通过检测PCNA、Ki-67表达检测其对肿瘤细胞增殖的影响,通过检测BCL-2表达检测其对肿瘤细胞凋亡的影响。Western blotting 检测 VEGFR2 通路和 JAK2/STAT3 通路关键分子 VEGFR2/p-VEGFR2,JAK2/p-JAK2,STAT3/p-STAT3及下游缺氧诱导因子HIF-1α表达,初步探索阿帕替尼对宫颈癌细胞VEGFR2通路及JAK2/STAT3通路活化状态的影响及其下游靶基因HIF-1α分子表达的影响。研究结果:①荷瘤裸鼠血细胞分析显示:荷瘤裸鼠的Apatinib组和Apatinib+放疗组,与对照相比,可见白细胞计数轻度下降,并可见轻度的贫血,但是差异不显著(P>0.05)。血细胞分析结果未见其他血液学毒性反应。②各实验组荷瘤裸鼠的心、肝、肾组织经HE染色证实均未见明显损害,与对照组无明显差异。③宫颈癌裸鼠皮下异位移植瘤的生长曲线(Growth curve)的结果可以看出:Experimental组肿瘤生长较Control组均减慢,Apatinib+放疗组肿瘤最小。SiHa细胞移植瘤生长速度及最终重量依次为:对照组(1.80g±0.60g)>Apatinib组(0.97g±0.17g)>放疗组(0.33g±0.23g)>Apatinib+放疗组(0.32g±0.08g),有统计学差异(P<0.05)。HeLa细胞移植瘤依次为:对照组(1.01g±0.30g)>放疗组(0.74g±0.32g)>Apatinib 组(0.57g±0.20g)>Apatinib+放疗组(0.48g±0.26g),有统计学差异(P<0.05)。SiHa和HeLa两种细胞的裸鼠移植瘤,Apatinib+放疗联合治疗组的抑瘤率最高,SiHa细胞移植瘤Apatinib+放疗组的抑瘤率(84.4%±4.38%)明显高于Apatinib组(46.24%±9.52%)及放疗组(71.03%±12.85%)。HeLa 细胞移植瘤 Apatinib+放疗组抑瘤率(73.04%±6.04%)也高于 Apatinib 组(43.59%±19.82%)及放疗组(52.33%±3.25%)。④通过对移植瘤进行CD31免疫组化检测,测得各组的肿瘤微血管密度(MVD)。结果可以看出:实验组的微血管密度与对照组相比较,可以看到显著降低,尤其是Apatinib+放疗联合治疗组,其MVD最低,对血管生成抑制的作用是各组中最强的,有统计差异(P<0.01)。通过免疫组化的方法,我们检测各组的PCNA、Ki-67以及BCL-2分子的蛋白表达情况,分析发现Apatinib及放疗均可抑制上述分子表达,Apatinib+放疗联合治疗组表达最低(P<0.01),对肿瘤增殖抑制作用最强。⑤宫颈癌SiHa细胞裸鼠移植瘤在Apatinib药物干预后,经western blotting方法证实其可通过去磷酸化抑制VEGFR2通路及JAK2/STAT3通路活性,进一步抑制通路的下游分子HIF-1 α表达。Apatinib+放疗联合治疗组的信号分子p-VEGFR2,p-JAK2,p-STAT3表达较放疗组明显下降,相关信号通路抑制更明显,HIF-1 α表达也更低。宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤在Apatinib药物干预后各项指标与SiHa细胞趋势具有一致性。研究结论:①肿瘤生长曲线结果显示Apatinib可增加SiHa及HeLa裸鼠移植瘤对放射线的敏感性;②宫颈癌SiHa及HeLa细胞裸鼠移植瘤模型中,VEGFR2信号通路及JAK2/STAT3信号通路存在且处于高表达状态。③Apatinib对宫颈癌SiHa及HeLa细胞裸鼠移植瘤的放疗增敏效果可能是通过抑制VEGFR2通路及JAK2/STAT3通路活性,抑制下游HIF-1 α分子的表达,抑制肿瘤异常血管形成而实现的。第三章Apat i n i b通过VEGFR2通路及JAK2/STAT3信号通路增加宫颈癌细胞放疗敏感性的机制研究研究目的:阿帕替尼(Apatinib)高度选择性抑制VEGFR2通路,本文第二部分我们在体内动物实验中,已经证明了 Apatinib可以增加宫颈癌细胞裸鼠移植瘤对放射线的敏感性,并发现其放疗增敏效果与JAK2/STAT3通路密切相关。本部分实验,将通过建立体外的宫颈癌SiHa及Hela细胞实验模型,进一步探讨Apatinib对宫颈癌细胞放射线敏感性影响的机制。研究方法:(1)应用CCK-8实验,检测阿帕替尼(Apatinib)对宫颈癌细胞(Cervical Cancer Cell)的增殖抑制能力的影响。(2)应用克隆形成实验,建立体外细胞实验模型,检测阿帕替尼(Apatinib)对宫颈癌细胞(Cervical Cαncer Cell)的放射线敏感性的影响。(3)应用western blotting方法检测VEGFR2及JAK2/STAT3信号通路活性状态,以及下游的HIF-1α分子的蛋白表达水平,评价①Apatinib对相关信号通路状态及下游HIF-1α分子表达水平的影响;②Apatinib+放疗联合干预与单纯放疗相比,相关信号通路的活化状态以及下游HIF-1 α分子表达的变化;③Apatinib与STAT3通路阻断剂联合干预与单纯Apatinib干预相比,相关信号通路的活化状态以及下游HIF-1α表达的变化。研究结果:(1)CCK-8实验结果显示:阿帕替尼抑制宫颈癌细胞SiHa及HeLa细胞增殖,其 IC50 分别为(699.4±112.9)μM和(115.8±3.3)μM。(2)克隆集落形成实验结果显示:Apatinib+放疗联合干预组在各实验组中,对细胞增殖的抑制能力是最强的,明显高于放疗组,且抑制作用随着放射线的剂量增高而有所增加。(3)SiHa细胞VEGFR2与JAK2/STAT3信号通路western blotting检测结果显示:①阿帕替尼组(Apatinib)和对照组(Control)相比较而言,VEGFR2分子和STAT3分子表达变化不明显,但是p-VEGFR2,p-STAT3表达均明显下降,表现出明显的去磷酸化趋势;下游HIF-1α分子表达量降低;②Apatinib+放疗组与单纯放疗组相比,VEGFR2,STAT3分子表达变化不明显,Apatinib+放疗组比单纯放疗组的p-VEGFR2,p-STAT3,HIF-1 α分子表达下降明显;③Apatinib与STAT3通路阻断剂联合干预后与Apatinib组相比,STAT3分子表达变化不明显,但是p-STAT3,HIF-1α分子表达下降更明显。HeLa细胞药物干预后western blotting检测各项指标与SiHa细胞趋势具有一致性。研究结论:肿瘤异常血管的形成可导致肿瘤局部缺氧,降低了肿瘤细胞放疗敏感性。同时,缺氧又可调节缺氧诱导因子HIF1-α的增加,作用于血管内皮细胞(vascular endothelial cell,VEC)进一步促进肿瘤血管的生成,形成恶性循环。本篇论文对阿帕替尼放疗增敏机制提出假说:阿帕替尼通过去磷酸化机制抑制宫颈癌SiHa及HeLa细胞VEGFR2通路及JAK2/STAT3信号通路关键信号分子活性,导致下游HIF-1α分子的转录、表达减少,进一步抑制了恶性肿瘤细胞的增殖,而且有效阻断了肿瘤新生血管的形成,打破现有异常的脉管系统,恢复血流灌注及氧供,最终增加肿瘤细胞放疗敏感性。通过本部分实验,SiHa及HeLa细胞均验证了这个结论。