论文部分内容阅读
背景:膀胱癌是一个重要的公共问题,在美国,膀胱癌是第四高发恶性肿瘤,诊断列膀胱癌的患者远期生存率仅6%。膀胱癌是我国泌尿系统中最常见的恶性肿瘤,严重危害人民的健康。近年来我国部分城市肿瘤发病率报告显示膀胱癌发病率呈增高趋势。尽管化疗对晚期膀胱癌治疗有了明显改善,由于肿瘤的早期复发,预后仍然很差,同时因为膀胱癌的病程往往较长且需要间隔性的膀胱镜、尿细胞学和放射学等随访检查,使其成为美国治疗费用最昂贵的肿瘤之一。因此探索膀胱癌有效治疗的新方法已经成为临床上迫切需要解决的实际问题。TGF-β(transforming growth factorbeta,转化生长因子β)是一种多功能的多肽类细胞因子,在调节细胞生长和分化中起着重要作用,高水平的TGF-β能促进肿瘤血管生成、肿瘤细胞浸润、转移和免疫抑制的作用,大量研究发现,在肝癌、胃癌、肾上腺癌及膀胱癌细胞或/和患者血浆内TGF-β1表达量明显增高,肿瘤产生的高水平TGF-β1通过抑制T细胞激活因子IL-2的生成及活性而抑制T细胞增生,TGF-β能抑制外周淋巴结中树突状细胞(DCs)的生长及活性,还能直接增加肿瘤细胞的侵袭、增生能力,所以TGF-β是肿瘤发生、发展过程中重要的促进因子。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一组在结构上具有极大的同源性、能降解细胞外基质的锌离子依赖性内肽酶的总称,目前至少发现有26种。以往的研究表明MMPs的异常表达可能与肿瘤的发生、侵袭和转移有关,其中MMP2、MMP9的异常表达在恶性肿瘤中最明显,有研究表明TGF-β1通过对MMPs的调节而影响肿瘤的发生、发展。整合素家族(integrins)是一种细胞粘附分子,它由两个跨膜蛋白亚单位(α、β)构成,在哺乳动物中,共有18个α亚单位和8个β亚单位,它们可以组合形成24种整合素蛋白分子,通过与不同的细胞-细胞外基质分子(ECM)结合调节细胞粘附、迁移能力。最新的研究发现整合素β1(integrin-β1)亚家族在调节人类肿瘤细胞的迁移、侵袭、转移中发挥重要作用,而高表达的integrin-β1与膀胱癌的侵袭性相关。研究发现肿瘤组织中增高的TGF-β1会影响integrinα5、αv亚单位和整合素α3β1的表达,所以TGF-β信号通路成为肿瘤生物治疗中一个重要的靶点。在TGF-β信号通路中,TGF-β受体Ⅱ(TβRⅡ)先与配体TGF-β结合,随后TGF-β受体Ⅰ(TβRⅠ)识别并结合形成TβRⅡ-配体复合物,使TβRⅠ的GS区丝/苏氨酸残基磷酸化,磷酸化的TβRⅠ再将信号放大并进一步传递给信号通路的下游底物,磷酸化的TβRⅠ与下游的Co-Smads结合形成异聚体转移入细胞核内,通过和转录因子相互作用调节靶基因的表达,最终调节细胞迁移、侵袭、转移能力等。最新的研究中,通过多种方法作用于TGF-β信号通路中的受体蛋白、Smads等靶点达到阻断该通路的目的,其中TGF-β蛋白抗体、针对TGF-β基因的干扰RNA、作用于TGF-β受体或跨膜蛋白的小分子阻滞剂等研究较多,目前对TGF-β信号通路中各个靶点的研究在肿瘤生物治疗的研究中极其重要。目的:研究过表达的TGF-β1和作用于TGF-β受体Ⅰ的干扰RNA(TsiRNA)在体外对人膀胱癌T24细胞侵袭、转移能力的影响,同时进一步研究过表达的TGF-β1和TsiRNA对TGF-β受体Ⅰ基因表达和膀胱癌T24细胞迁移、侵袭能力相关蛋白表达的影响,并探讨其机制。方法:分别用Transwell-迁移试验、划痕试验以及Transwell-侵袭试验观察过表达的TGF-β1和作用于TGF-β受体Ⅰ的干扰RNA(TsiRNA)在体外对人膀胱癌T24细胞侵袭、转移能力的影响。蛋白免疫印迹法(Western Blotting)和RT-PCR技术检测TGF-β1和TsiRNA处理后一些侵袭、迁移相关因子基因、蛋白表达水平的变化,包括MMP2,MMP9,α3,β1以及α2。统计学处理用SPSS13.0软件完成,计量资料数据表示方式以平均值±标准差(Mean±SD),两组计量资料采用非独立样本t检验,各组指标间的相关性采用Spearman等级相关分析。P＜0.05为差异有统计学显著性意义。结果:本研究通过Transwell-迁移实验、划痕试验证明过表达的TGF-β1可以显著提高膀胱癌T24细胞的迁移能力,而TsiRNA可以完全降低由TGF-β1引起的T24的迁移能力变化,Transwell-侵袭试验显示过表达的TGF-β1可以显著提高膀胱肿瘤T24细胞的侵袭能力,而TsiRNA可以完全抑制TGF-β1的作用,Western Blotting、RT-PCR结果显示过表达的TGF-β1可以明显增加T24细胞中整合素亚单位α3、β1、α2以及MMP9的表达,而TsiRNA可以完全阻断TGF-β1引起的上述蛋白分子表达量的增加,这种表达量的变化趋势和T24侵袭、迁移能力变化趋势呈相关性。结论:本实验以人膀胱癌T24细胞系为对象,研究TGF-β1及TsiRNA对膀胱肿瘤迁移、侵袭性影响,研究发现过表达的TGF-β1明显增强膀胱癌T24细胞的侵袭、迁移能力,作用于TGF-β受体Ⅰ的干扰RNA通过阻断TGF-β信号通路降低T24细胞的侵袭、迁移能力,同时降低整合素蛋白和MMP9蛋白的表达,由此证明膀胱癌中过表达的TGF-β1及TsiRNA可能完全或部分的通过调节整合素蛋白和MMP9蛋白的表达而影响T24细胞的侵袭、迁移能力,所以应用TsiRNA阻断TGF-β信号通路有可能成为侵袭性膀胱肿瘤生物治疗的提供一定的理论基础。