鲤鱼、中华绒鳌蟹和大黄鱼微卫星标记的开发与应用研究

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近年来,我国的水产养殖动物普遍存在生产性能下降、抗逆性差、种质衰退和混杂等问题,这些问题已成为严重影响水产养殖业可持续发展的制约因素。本研究以鲤(Cyprinuscarpio)、中华绒鳌蟹(Eriocheirsinensis)和大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)作为研究对象,以共显性微卫星分子标记作为研究手段,对微卫星标记在连锁图谱构建、种质鉴定、遗传衰退评估和分子标记辅助育种等研究领域应用的可行性进行了摸索与探讨。 通过小片断克隆法、生物素-磁珠选择性杂交、检索鲤EST序列、筛选鲤SSH-cDNA文库、借用斑马鱼微卫星标记及收集公开发表的鲤微卫星标记等开发策略,共获得鲤SSR多态性标记1682个。选用700个标记对鲤雌核发育家系进行多态性筛选,结果有287个标记的遗传模式符合遗传连锁图谱的构建要求。结合AFLP和RAPD标记构建鲤雌核发育F2遗传连锁图谱。结果这3类标记中共有445个标记发生连锁,分布于50个连锁群,其中RAPD标记16个,AFLP标记265个,微卫星标记164个,连锁群长度从9.39cM到208.75cM,每个连锁群含2-32个标记。图谱长度为3732.52cM,各连锁群平均图距在4.65到29.19cM之间,总平均图距为11.19cM。鲤遗传图谱的预期长度为4803.39cM,图谱的覆盖率为77.71%。 利用生物素-磁珠选择性杂交和放射性同位素辅助筛选的方法克隆了中华绒鳌蟹的SSR标记,结果从85对SSR引物中获得多态性标记39个,另收集公开发表的中华绒鳌蟹标记12个,共获得绒鳌蟹多态性标记51个。利用其中的25个标记对来自江苏和安徽良种场、天津和辽宁私人养殖场的4个群体进行了遗传多样性和遗传结构分析。遗传多样性检测显示4个群体的观察杂合度是0.5789-0.6824,来自良种场两个群体的杂合度均高于养殖场,近交系数低于养殖场。遗传结构分析表明,虽然4个分析群体的遗传分化较弱(Fst值为0.103),属于同一个物种,但是基于遗传距离的UPGMA聚类图显示,来自江苏、安徽和天津的3个绒鳌蟹群体聚在一起,而来自辽宁的辽河蟹个体单独聚为一支。个体混杂检测表明,长江蟹中已混杂有其它水系的绒鳌蟹。 利用生物素一磁珠选择性杂交和放射性同位素辅助筛选的方法克隆了大黄鱼的SSR标记,结果从35对SSR引物中获得多态性标记11个,另收集公开发表的大黄鱼标记6个,共获得大黄鱼多态性SSR标记17个。利用其中的15个标记首次对人工繁殖大黄鱼群体的F2和F3连续两代8个群体250个样品进行了遗传差异分析。遗传多样性检测显示,F2的4个群体的观察杂合度均高于F,表明连续累代繁殖已造成大黄鱼养殖群体遗传多样性的下降。等位基因频率分析显示有53.0-66.5%的等位基因频率低于0.05,说明低频等位基因的丢失可能是造成养殖大黄鱼群体遗传多样性下降的主要原因。经过一代繁育,F2和F3在等位基因频率上存在34.13%的遗传差异,遗传分歧增加约1%,进一步表明连续累代繁殖降低了大黄鱼的遗传可塑性。因此,十分有必要对大黄鱼繁育亲本进行遗传筛查,执行已遗传管理为指导的繁育计划,避免近交衰退。本研究利用15个SSR标记估算了189尾繁育亲本个体间的遗传距离,以避免近亲交配为原则,将189尾亲本划分为A、B两组进行群体繁育。对照组子代在疾病暴发期间全部死亡,而标记指导繁育的A、B两组子代都有近一半个体成活。目前两组子代生长良好。另外,通过建立标记与性状的相关性分析,我们找到了一个与大黄鱼体重、体长紧密相关的SSR标记。
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