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第一部分:p38 MAPK在NTHI致人单核细胞炎症反应中的作用目的:通过不可分型流感嗜血杆菌与单核细胞相互作用,研究丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号传导通路在不可分型流感嗜血杆菌(nontypeable haemophilus influenza,NTHI)致人体免疫细胞炎症反应的作用。方法:NTHI为浙江大学医学院附属第二医院临床分离株,经血清学和16sRNA测序证实,外周血单核细胞分离自健康成年人的静脉血。NTHI与单核细胞共培养,1 h、4 h后收集细胞用Western Blot检测p38、p44/42-MAPK的磷酸化;16 h后用流式细胞仪检测细胞表面TLR4的表达。预先用p38-MAPK抑制剂(SB203580)和p44/42-MAPK抑制剂(UO126)与单核细胞共孵育1 h,然后加入NTHI(感染复数:200),分别在4 h、16 h后收集上清,以酶联免疫吸附法检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平。结果:NTHI能迅速地诱导p38,p44/42-MAPK通路的磷酸化,并至少持续到刺激后4 h。与未加细菌组比较,NTHI刺激16h后单核细胞表面TLR4受体表达明显增加,上清中TNF-α增加(p＜0.05)。与细菌攻击组比较,阻断p38-MAPK,而不是阻断p44/42-MAPK通路,能显著地降低单核细胞分泌TNF-α(p＜0.05)。结论:TLR4可能参与了NTHI致单核细胞炎症反应;p38-MAPK是NTHI诱导单核细胞炎症反应的关键信号分子。第二部分:NTHI致呼吸道上皮细胞炎症反应的分子机制研究目的:通过建立呼吸道上皮细胞株的体外NTHI感染模型,确认NTHI在细胞内的存活,观察NTHI及其组分(可溶性胞质成分SCF、外膜蛋白EP)对呼吸道上皮细胞MAPK信号传导通路和后续的前炎症因子表达的影响,并应用特异性ERK-MAPK抑制剂U0126、p38 MAPK抑制剂SB203580特异性阻断下游MAPK信号传导通路,观察它们对呼吸道上皮细胞分泌前炎症因子表达的影响。方法:NTHI系临床分离株,经常规和基因测序鉴定。NTHI与气道上皮细胞共培养,透射电镜观察A549细胞内定植,12h后Triton破膜,再行培养证实细菌存活;Westernblot检测A549及BEAS-2B细胞p-p38和p-ERK MAPK蛋白的表达;超声打碎细胞,超速离心分离NTHI可溶性胞质成分和外膜蛋白,流式细胞仪测定A549细胞NF-κB p65的表达;ELISA测定A549和BEAS-2B细胞IL-8的表达。结果:NTHI在感染A549细胞4h后即有大量NTHI进入胞内,且细胞内的NTHI数目与感染时间和细菌数目成正比;用Triton X-100破膜,对胞内细菌行体外培养,在巧克力平板上过夜后即见NTHI生长。Western blot显示:NTHI刺激15min-30min后,A549细胞内的p-p38和p-ERK MAPK表达开始增加;NTHI刺激15min-30min后,BEAS-2B细胞内的p-p38、p-ERK MAPK表达开始增加。流式细胞法显示:NTHI和SCF、EP刺激4h后,A549细胞内NF-κB p65的表达较培养基组明显增强;与培养基对照比较,NTHI、SCF、EP组均明显增强,其中完整NTHI作用最强。A549在NTHI刺激后IL-8分泌增加,可被SB203580抑制,但不被UO126抑制。BEAS-2B细胞在NTHI刺激后IL-8分泌增加,可部分被两种MAPK抑制剂所抑制。结论:NTHI可以进入A549细胞并存活,是兼性的胞内菌;NTHI及其菌体成分对肺上皮细胞均有较强的致炎作用,完整细菌的作用最强;p38MAPK、ERK MAPK和NF-κB均参与NTHI致气道上皮炎症反应,但MAPK参与NTHI致肺泡上皮细胞和支气管上皮细胞的炎症反应时的通路有所不同,p38可能是主要的信号传导通路。第三部分:NTHI感染对气道上皮细胞AA-COX-PGE2代谢途径的影响和分子调控机制目的:通过建立NTHI感染气道上皮细胞的体外模型和小鼠的感染模型,研究NTHI诱导气道上皮细胞和肺组织COX2和PGE2的表达,揭示Toll样受体在NTHI致气道上皮细胞和肺组织炎症反应中的作用,同时阐明p38MAPK和NF-κB两条信号传导通路的作用及两者之间的关系。方法:用不同浓度的NTHI感染A549细胞以建立细胞体外感染模型。Western blot检测p38MAPK的磷酸化,电泳迁移率试验测定NF-κB DNA结合活力,COX-1、COX-2 mRNA和PGE2蛋白的表达分别采用逆转录聚合酶链反应和酶联免疫吸附试验。用高表达TLR2和TLR4的HEK293细胞试验以及用TLR2、TLR4基因敲除小鼠体内试验,研究TLR2、TLR4在COX-2表达中的作用。另外,用特异性分子抑制剂阻断p38MAPK和NF-κB来揭示两条信号传导通路的作用。结果:在A549细胞NTHI诱导COX-2 mRNA表达呈剂量相关性,但不影响COX-1 mRNA的表达。NTHI感染引起的PGE2表达增高可以被特异性的COX-2抑制剂所抑制,但不被COX-1抑制剂所抑制。NTHI诱导的COX-2表达在上皮细胞的体外试验和肺组织的体内试验中都是通过TLR2介导的。NTHI可以诱导p38 MAPK磷酸化和NF-κB DNA结合活力的上调,COX-2和后续PGE2可以被p38 MAPK及NF-κB特异性抑制剂所阻断;但是NTHI诱导的NF-κB DNA结合活力的上调不受p38 MAPK抑制剂的影响。结论:NTHI感染气道上皮细胞是通过COX-2而非COX-1引起PGE2表达增高;无论是体外还是体内,TLR2是介导NTHI诱导COX-2和PG E2表达的主要表面受体;NTHI诱导COX-2和PGE2表达是通过p38 MAPK及NF-κB两条信号传导通路进行调节的,两者之间是相对独立的。